Microsatélites de Cromosoma Y: Estudio de cinco marcadores genéticos en población de Nicaragua. Visión futura de su aplicación para la resolución de casos de criminalística biológica en el Laboratorio de Criminalistica, Policía Nacional; Nicaragua.
1. 1. INTRODUCCIÓN
En la actualidad el método más exacto y confiable para identificar a un individuo es el tipado de su ADN. Sus análisis se centran en determinar la presencia de variantes genéticas o marcadores genéticos de características hereditarias, según los principios mendelianos y que son propios de cada ser; una seguridad que no la posee ningún otro procedimiento (caracteres morfológicos o de grupos sanguíneos) por ser de precisión muy limitada.
Los marcadores que más se utilizan para su estudio son los llamados STRs (Short Tándem Repeat), investigándose, según variadas experiencias, entre 6 hasta 20 marcadores, cada uno de los cuales poseen entre 5 y 12 variantes alélicas reconocidas e identificadas por letras y números concertados según la nomenclatura internacional.
Los STRs son regiones altamente polimórficas compuestas por una secuencia de 2 hasta 7 pb, que se repiten en tándem de cuya variación procede la base de su polimorfismo genético.
El uso de marcadores STRs dado el pequeño tamaño de sus alelos o variantes genéticas (100 – 400 pb) en el caso de los microsatélites del cromosoma Y, los hacen ser los elementos más idóneos en las aplicaciones forenses, cuando la presencia de ADN está generalmente en condiciones degradadas.
Entre varios tipos de sistemas STR, las repeticiones tetranucleotidicas son las más utilizadas durante la última década en el campo de la identificación humana, caracterizados por ser de pequeñas longitudes en su tamaño, baja presencia de “stutter bands” (bandas tartamudas), gran precisión del tamaño de sus alelos y la posibilidad de análisis simultáneos de varios STRs mediante el método multiplex-PCR.
Una de las grandes ventajas de los STRs consiste en el hecho de que permiten una identificación de perfiles fiables, independientemente del tipo de análisis que se utilice.
Sus análisis, por excelencia, son realizados mediante técnicas de PCR (Polimerase Chain Reaction) cuyo equipamiento incluye un aparato termociclador encargado de amplificar el componente genético; un secuenciador automático que determine y delimite el material genético; y como es obvio, un personal especializado para la interpretación de sus resultados, tanto para resolver casos de identificación individual; como para resolver situaciones complejas involucradas dentro del ámbito judicial.
Este tipo de estudio ofrece entre otras ventajas principales, las siguientes:
- Confiabilidad del 99.999% en la identificación de un ser.
- Posibilidad de conocer una filiación biológica a partir de pequeñas muestras: manchas de fluidos biológicos, pelos, dientes, huesos, etc.
- Método simple de obtención de muestras, sin tener que hacer uso de envíos y manipulación de grandes muestras líquidas de material biológico.
- Fácil almacenamiento de las muestras
- Procesamiento y análisis de las muestras en corto tiempo (horas) etc.
La genética poblacional humana utiliza la distribución de marcadores genéticos en poblaciones humanas estáticas para establecer una visión en la historia demográfica y migratoria. Estudios sobre los polimorfismos proteícos “clásicos” (variación de grupos sanguíneos, HLA y ADN mitocondrial) dentro de la población, han contribuido en la comprensión del origen humano y sus dispersiones a través del tiempo de igual forma que las nuevas técnicas en biología molecular han revelado patrones similares.
Estudios de la porción no recombinante del cromosoma Y (NRY) han sido aplicados al estudio de la historia humana. La presencia de dos características lo hacen el más apropiado para estas investigaciones: Heredabilidad de padre a hijo sin efecto aleatorio de la recombinación; lo que permite la evolución y retención de una amplia variedad de haplotipos estables con edades variables que se relaciona con un proceso secuencialmente mutacional; y un Patrón geográfico altamente específico de la variación NRY con una diversidad menor que otros marcadores dentro de las poblaciones y con una variabilidad más elevada.
Con el presente trabajo se pretende dar pauta a la aplicación de marcadores genéticos (marcadores del cromosoma Y) con el estudio de ADN en Nicaragua, principalmente en aquellos casos cuyos procedimientos técnicos sean propuestos para la práctica forense; al igual que preparar las condiciones para la creación de un banco de datos, compuesto por un número importante de marcadores genéticos de cromosoma Y, dentro de la población en estudio, como respuesta “moral” al avance científico dado por la Comunidad Internacional guiadora y forjadora de su estudio.
1. 2. JUSTIFICACIÓN
El
análisis de los STRs se han convertido en el mundo de las ciencias forenses, el
punto primordial de partida para la creación de bases de Datos Poblacional de
perfiles genéticos de ADN; lo que justifica el importante esfuerzo que puede
realizarse a fin de desarrollar un sistema de análisis de varios marcadores
genéticos, que permitan el estudio de su comportamiento en una población
determinada.
El
conocimiento de las Frecuencias alélicas y del comportamiento en la población
de cualquier loci candidato a ser usado en Genética Forense es indispensable y
condición previa necesaria para poder informar adecuadamente, ante un tribunal,
acerca de los resultados en pruebas de identificación genética y de parentesco
biológico (pruebas de paternidad). Por otro lado, los estudios de distribución
de frecuencias sobre los que se base ese conocimiento vienen a aportar una
información fundamental desde la perspectiva Antropológica y de la Genética
Poblacional.
Por
lo anteriormente descrito, se resume que el objetivo de la validación de los
marcadores genéticos moleculares antes de su aplicación en la rama forense y
criminal exige un completo conocimiento del uso de su sistema y la
caracterización de su comportamiento en el análisis de casos reales. Por lo
tanto, a fin de poder realizar un análisis de la individualidad biológica en el
estudio de casos forenses (civiles, criminales, etc.) en los que pobladores de
Nicaragua se vean involucrados, se plantea llevar a cabo este trabajo
investigativo en el que se pretende alcanzar los siguientes objetivos:
1. 3. OBJETIVOS
1. 3.1 OBJETIVO GENERAL:
-
Iniciar la caracterización genética de la
población en Nicaragua mediante el estudio de cinco marcadores microsatélites
de Cromosoma Y, que den pauta al proyecto de su aplicación en los casos de
interés criminalístico en el Laboratorio Central de Criminalística (LCC) de
1. 3.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS:
-
Dar pauta a la posibilidad de crear una
base de datos de polimorfismo ADN en el LCC de
-
Estimar las frecuencias alélicas con que
se presentan cada uno de los cinco marcadores genéticos STRs de Cromosoma Y en
la población de Nicaragua.
-
Estimar las frecuencias haplotípicas con
que se presentan los marcadores microsatélites de Cromosoma Y en la población
de Nicaragua.
1. 4. OPERACIONALIZACION DE LAS VARIABLES
- VARIABLE INDEPENDIENTE:
- Microsatélites
de Cromosoma Y
- DIMENSION DE LA VARIABLE:
- Sistema
Uniplex.
- Sistema Múltiplex
- INDICADORES:
- Sistema
Uniplex: DYS19
-
Sistema Múltiplex: GEPY II (GATA A7.1, DYS439, GATA H4
y GATA A10).
- INDICE:
-
Frecuencias
Alélicas
-
Frecuencias
Genotípicas
-
Frecuencias
Haplotípicas.
1. 5. MARCO TEORICO
1. 5.1 ANTECEDENTES HISTORICOS:
El estudio de la variabilidad genética como medio de
identificación humana se inició con el análisis de los grupos sanguíneos,
específicamente con el estudio de los antígenos eritrocitarios (Hirschfeld y
Hirschfeld, 1919). Posteriormente se continuó a través del análisis de
proteínas séricas, enzimas leucocitarias,
eritrocitarias y del sistema HLA (Antígeno Leucocitario Humano); este
último descrito como el primer sistema polimórfico analizado por PCR (Reacción
en Cadena de
Fue
así que en 1985 Alec Jeffreys y cols. Describirían un método de identificación
individual al que denominarían “DNA fingerprinting” o huella genética,
prometiendo ser la solución definitiva en el análisis de la diversidad humana
desde la Medicina Legal, tanto para la Investigación Biológica de la Paternidad
como en Criminalistica. En este primer momento se pensó que la incorporación de
este método a la práctica forense fuera bloqueado debido a problemas
estrictamente legales (Jeffreys, 1993); sin embargo, la historia demostraría
que esta predicción era extremadamente pesimista, dado que en abril de ese
mismo año, en ese mismo estado de Inglaterra era resuelto satisfactoriamente un
problema de inmigración por medio de este método tecnológico (Jeffreys y cols,
1985 a). Muy poco tiempo después, se admitiría también en un tribunal
británico, la investigación biológica de la paternidad basada en la prueba del
ADN (Gill y Werret, 1987).
En
1987, el uso de la denominada “huella genética” o “DNA fingerprinting” había
sido ya admitido en los procesos penales, tanto en Inglaterra como en USA; y en
1988, el Ministerio del Interior Británico y el de Asuntos Exteriores y
Commonwealth, ratificaron el uso de esta técnica para la resolución de casos de
inmigración en los que hubiera que dilucidar la existencia o no de relaciones familiares
(Home Office, Londres, 1988).
En
la actualidad, se puede afirmar que la prueba del ADN científicamente está
consolidada su valor ante los tribunales. Para estudiar los problemas que
surgen por la aplicación forense de nuevos polimorfismos de ADN y con el animo
de estandarizar métodos y establecer un riguroso control de calidad, surgió
hace varios años en EEUU
En
Nicaragua, como en muchos países en vías de desarrollo, este tipo de desarrollo
en la investigación criminal aun es de carácter desconocido y novedoso, dado
sus condiciones socio-económicas que dificultan dicho progreso, haciéndose
valer de otros sistemas para el esclarecimiento de causas criminales y el
auxilio de su administración de justicia.
1.5.2 CONCEPTOS BÁSICOS
POLIMORFISMO: es todo aquel locus del ADN que tiene dos o más variables alélicas, y la frecuencia de cada una de ellas supera el 1% dentro de la población.
GENOMA: Colección
completa de genes que codifican a un determinado organismo.
El es todo el material genético de un ser vivo.
El genoma está compuesto por cromosomas. Los cromosomas contienen genes, y los genes están compuestos por ADN. La secuencia completa del genoma humano anunciada en Junio del 2000, es un genoma representativo basado en el ADN de algunos individuos.
La mayoría de sus variaciones se encuentran afuera de los genes, en el
ADN extra que no afecta las características de una persona. Científicamente se sabe que los polimorfismos pueden
afectar, tanto como las mutaciones, las características de una persona, pero de
una forma más compleja y a veces inesperada.
GEN: Su término aparece por primera vez en
1900 como un concepto abstracto que Johansson proponía para explicar la base
hereditaria de los rasgos. En 1930, Beadle introdujo el concepto “un gen, una
enzima” que más tarde se convertiría en “un gen, un polipéptido”.
Biológicamente es el elemento encargado
de llevar la información para la elaboración de todas las proteínas requeridas
por el organismo.
En términos
biomolecular significa: “Segmento completo de cromosoma requerido para hacer un
producto funcional”.
La definición más aceptada es la que proviene del investigador
G. C. Williams: Porción de material cromosómico que, potencialmente, permanece
durante suficientes generaciones para servir como una unidad de selección
natural.
La estimación inicial del número de genes en el ADN humano oscilaba entre los 50.000 y los 100,000, más tarde (14 abril del 2003) se comprobó que solo eran entre 26 mil y 30 mil genes aproximadamente. Calculándose apenas que del 2 al 3% aproximadamente de los 3 billones de pares de bases, lo conforman los genes.
DNA: (ácido desoxirribonucleico) Elemento biomolecular que contiene la información genética.
Si se pudiera
juntar todo el DNA (1,826cms/célula) del cuerpo en forma de escalera se
cubriría una distancia de 600 viajes de la tierra al sol, ida y vuelta (aprox.
149,000,000 kms).
Cada 1.8 mts de longitud de la cadena de ADN
contiene más de 3 billones de pares de bases nitrogenadas. Es considerado el
secreto de la vida. Su modelo físico fue descrito por James Dewey Watson y
Francis Harry Compton Crick en 1953.
Comprender como el DNA realiza la función requiere de
conocimiento de su estructura y organización.
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Gráfico No. 1. ESQUEMA GRAFICO DE UNA
MOLECULA DE ADN
CROMOSOMA: Componente celular que ayudan a
mantener una cantidad de información en forma ordenada y compacta. Están
compuestos de ADN y proteínas. Su número depende de la especie (mosquitos 6,
hombre 46, chimpancé 48, perro 78) aunque se asemejen en apariencia, los
diferentes cromosomas varían en tamaño y en forma. Al teñirlos con colorantes
fluorescentes desarrollan diferentes patrones en forma de bandas claras y
oscuras.
Alelo: Genes con secuencias nucleotídicas diferentes.
Locus. (del latín lugar) Lugar que ocupa un gen en un cromosoma, puede estar ocupado por alelos o alternativas de un gen diferentes.
Marcadores polimórficos. Variaciones en la secuencia del ADN que se transmiten de generación en generación de forma mendeliana. Permiten diferenciar alelos en un locus determinado de cromosomas homólogos. Sirven para estudiar los modelos de transmisión de los diferentes genes por el método indirecto del análisis de ligamiento genético.
Intrón: cada uno de los fragmentos de ADN que no son capaces de expresarse bajo la forma de una proteína.
- Es una secuencia no codificadora de ADN que separa a dos exones. El intrón inicialmente se transcribe en la molécula de ADN mensajero pero después es eliminado durante el proceso de maduración del ARN. Alrededor del 98.5% de nuestro genoma (restando el 1.5% que corresponde a secuencias codificadoras de genes humanos) es “ADN basura”.
Gráfico No.2. Explicación Gráfica de Intrón. De Nacional Human Genome
Project.
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1.5.3 QUE ES EL ADN?
El ADN (Ácido Desoxirribo Nucleico) constituye el material
genético de las células del cuerpo humano. En el genoma (conjunto
integral y secuenciado del ADN) humano se estima que hay aproximadamente 30,000
ó más genes. Los genes son trozos funcionales de ADN compuestos a su vez
de1,000 hasta 200,000 unidades c/u llamadas nucleótidos. Los nucleótidos
se encuentran organizados formando un par de cadenas apareadas que toman la
forma tridimensional de un doble hélix. Hay más de (3,000'000,000) tres mil
millones de pares de bases que constituyen el genoma de una sola célula
humana.
Cada nucleótido del ADN está compuesto de tres subunidades:
una base nitrogenada, una desoxiribosa y un grupo fosfato. Hay cuatro tipos de
bases nitrogenadas en los nucleótidos del ADN: timina (T), citosina (C),
guanina (G) y adenina (A). Es importante resaltar que así como hay regiones con
función conocida o supuesta (los genes), sucede que casi la mitad del ADN del
genoma humano consiste de regiones (intrones) con función hasta hoy
desconocida y que tienen una secuencia de nucleótidos repetitiva en
muchos casos, pero con patrones hipervariables en muchas regiones del
genoma.
Es precisamente de la hipervariabilidad (polimorfismo) de
estas regiones del ADN de lo que se aprovecha para detectar diferencias (o
semejanzas) entre un ser humano y otro, estudiando su ADN. Las regiones
repetitivas pueden presentarse como tandas repetitivas cortas o largas. A esto
se le llama VNTRs (variable number of tandem repeats) entre los que
están los STR (short tandem repeats), que son las regiones
hipervariables que se estudian para las pruebas modernas de paternidad.
Toda célula nucleada contiene 46 cromosomas (excepto los gametos: Los espermatozoides en el hombre y los óvulos en la mujer, que tienen 23 cromosomas cada uno). Los cromosomas son tan sólo la forma como la célula ordena su ADN combinándolo con ciertas proteínas.
En el momento de la concepción, se necesita 46 cromosomas
para procrear un nuevo ser humano. En consecuencia, una persona debe recibir
exactamente la mitad de su material genético de su madre biológica y
exactamente, la otra mitad del padre biológico.
1.5.4 CARACTERISTICAS BIOMOLECULARES DEL ADN:
El ADN es un polinucleótido constituido por dos cadenas antiparalelas de unidades de desoxirribonucleótidos unidos covalentemente, dispuestos de una forma complementaria y adoptando una estructura enrollada de doble hélice dextrógira. Las bases que forman los nucleótidos son la adenina (A), guanina (G), citosina (C) y timina (T).
Su
estructura fue descubierta por James WATSON y Francis CRICK en 1953, lo cual
permitió afrontar su estudio de forma directa.
Gráfico
No. 3. Estructura Bioquímica del ADN.
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1.- ADN CODIFICANTE O ESENCIAL.
Es el encargado de almacenar la información genética en los genes, que son los diferentes sectores de ADN con un orden concreto en la disposición de los nucleótidos que determina la secuencia de aminoácidos de las proteínas que codifican y el grado de expresión del gen en cada tejido y en cada tiempo.
2.- ADN NO CODIFICANTE.
ADN cuya función específica es desconocida, aunque se sabe que no guarda información genética y que juega un importante papel en la estructura y en la función de los cromosomas y, sobre todo, actuando como puntos precisos de recombinación.
El
estudio del genoma humano es complejo y está dividido en función de su
repetitividad y de su carácter codificante. Un 50-70% del Genoma humano está
constituido por lo que se denomina el DNA de Copia única simple
o no repetitivo. Parte de este DNA aproximadamente 5% lo
forman las secuencias de genes, que codifican los RNAs y proteínas celulares;
5% es responsable del control de la expresión de esas secuencias, mientras que
el resto (aproximadamente 60%) es DNA no codificante, cuya función, si existe
apenas se conoce; un 20 y un 50% del total
del genoma humano está constituido por el DNA Repetitivo. Las secuencias
repetidas, llamadas Unidades de Repetición o simplemente repeticiones,
tienen tamaños diversos y cada uno se encuentra de forma idéntica o casi
idéntica muchas veces en el genoma. Esta distribución puede ser en forma
dispersa por todo el genoma, entremezcladas con las secuencias de copia única,
o bien de forma agrupadas localizadas en regiones concretas del cromosoma. En
ambos casos, el número de copias de la unidad de repetición varía desde unos
cientos o miles conocido como DNA moderadamente repetitivo hasta cientos de
miles o DNA altamente repetitivo.
El DNA Moderadamente Repetitivo se encuentra disperso por el genoma en forma de bloques o en tandem en un promedio de uno cada 10.000 nucleótidos (Edwards y cols; 1991) y está subdividido en dos grupos en función de las unidades de repetición (UR) de cada bloque en:
1. Minisatélites donde la UR es de 10-65 pb
2. Microsatélites o STR (Short Tandem Repeat) donde la UR es de 2-6 pb.
Este ADN puede ser de dos tipos: ADN espaciador o intrón,
el cual está formado por una secuencia sencilla de bases que se dispone entre
regiones codificantes del genoma; y ADN repetitivo, que lo forma
una secuencia que, al contrario que el espaciador, se dispone por todo el
genoma debido a la existencia de múltiples copias. A su vez este ADN repetitivo
se divide según las características de la secuencia en "Secuencias
repetidas en tándem", en las que existe una secuencia común
relativamente corta que se repite en tándem de manera continua (una tras otra)
en un fragmento de ADN.
---- ATCGG ATCGG ATCGG ATCGG ATCGG ----
y "Secuencias repetidas intercaladas", tratándose de una secuencia larga de bases que aparece repetida, pero no a continuación del primer grupo de secuencia repetitivo, sino en un lugar diferente y distante del genoma:
------- ATCCCCGGGAATCGATAAACGGATC
----------------------- ATCCCCGGGAATCGATAAACGGATC
Las características generales del ADN no codificante lo hacen especialmente útil para su aplicación a la identificación en Medicina Forense por presentar una gran variabilidad de unos individuos a otros. Las variaciones debidas a cambios sencillos de bases, procesos de inserción-delección o de intercambio de ADN (recombinación) durante la formación de las células germinales (meiosis), hacen que se modifiquen el número de repeticiones o el orden de las bases de un determinado fragmento repetitivo, pudiendo producirse en un locus sencillo o en múltiples loci, siendo este el origen de la variación que hace que no haya dos personas que tengan la misma secuencia del ADN, a excepción de los gemelos univitelinos.
La repercusión práctica de lo anterior es la existencia de diferentes alelos; es decir la posibilidad de encontrar entre la población varias formas en el número de repeticiones STR es altamente variable entre individuos, lo que aporta la característica del polimorfismo y hacen que sean efectivos en la identificación humana.
Los STR se han popularizado porque son fácilmente amplificados por PCR, sin problemas de amplificación preferencial. Esto es debido a que ambos alelos en individuos heterocigotos son de tamaño similar y la unidad de repetición es pequeña.
Una de las grandes ventajas del ADN está dada por su presencia en todos los indicios y su localización celular tanto nuclear como mitocondrial, lo que hace posible la aplicación de las mismas técnicas de extracción y análisis, independientemente de cual fuere el origen del indicio que lo contiene.
1.5.5 CITOGENETICA
DEL CROMOSOMA Y
El cromosoma Y es un cromosoma pequeño (60 Mb), de cromatides acrocéntricas. Representa el 2% del complemento cromosómico. La eucromatina forma el cuerpo principal del cromosoma, tiene un tamaño constante (28 Mb) que incluye el brazo corto (Yp11); el centrómero y la parte proximal del brazo largo (Yq11) (Roewer, 1998). La región eucromática es transcripcionalmente activa, para el estudio de sus secuencias éstas se clasifican en cuatro grupos:
- Secuencias homólogas al cromosoma X
- Secuencias repetitivas centroméricas
- Familias de secuencias repetitivas específicas del cromosoma Y
- Copias únicas específicas del cromosoma Y (Hammer y Zegura, 1996)
Presenta un tamaño variable en masculinos fenotípicamente normales, que puede ser indetectable o tener una extensión superior a la mitad del cromosoma Y.
El 60% de su ADN está constituido por secuencias polimórficas altamente repetitivas. Debido a la falta de un elemento homólogo, la mayor parte del cromosoma Y no se recombina durante la meiosis. Esta falta de recombinación determina que todas las secuencias ubicadas en esta zona se hereden como un bloque constituyendo un grupo de ligamiento que se transmite intacto de padres a hijos formando haplotipos. (Roewer, 1998)
Evolutivamente un doble proceso de inactivación del cromosoma X y deterioro del cromosoma Y, ha conducido a la conformación actual de dos regiones pseudoautosómicas en el cromosoma Y (único sitio de recombinación con el cromosoma X): PAR 1 y PAR 2 (PAR: Pseudo-Autosomal Regions) con un tamaño aproximado de 2,600 y 320 Kb (Jobling, 1997; Vogt y cols., 1997; Ellis, 1998)
Skaletsky y cols, 2003; describen la secuencia completa de 23 Mb del segmento de eucromatina del cromosoma a la que designan como “región específica masculina de Y (“male-specific region of the Y o MSY”
1.5.6 POLIMORFISMO DE CROMOSOMA Y
1.5.6.1 ANTECEDENTES DEL EMPLEO
DE MARCADORES HIPERVARIABLES DEL CROMOSOMA Y
Inicialmente los estudios se basaron en el análisis de la región denominada “Y27H39” (Actualmente conocida con DYS19) de gran utilidad tanto en estudios antropológicos (Roewer y cols, 1993) como en análisis de paternidad, cuando no se cuenta con la presencia del progenitor masculino (Santos y cols, 1993).
La detección y validación de gran número de secuencias polimórficas presentes en el cromosoma Y, posibilitó la realización completa de estudios poblacionales y su inmediata aplicación en estudios de filiación como en casos forenses (Kayser y cols, 1997; Prinz y cols, 1997)
La identificación de nuevos STR se basa en la siguiente forma:
- Búsqueda de secuencias de DNA en base de datos. Ejemplo: GenBank, de regiones con 6 o más unidades de repeticiones contiguas (Weber y May, 1989)
- Aislando ADN con métodos de Biología Molecular (Edwards y cols, 1991)
Resumen cronológico del descubrimiento de STRs de Cromosoma Y:
-
1992:
DYS19 (Roewer y cols)
-
1994:
YCAI a/b, YCAIIa/b, DXYS156 (Mathias y cols)
-
1996:
DYS389 I/II, DYS390, DYS391, DYS392, DYS393 (Roewer y cols)
-
1997:
DYS288, DYS388 (Kayser y cols)
-
1998:
DYS385 a/b (Schneider y cols)
-
1999:
A7.1, A7.2, A10, C4, H4 (White y cols)
-
2000:
DYS434, DYS435, DYS436,DYS437, DYS438, DYS439 (Ayub y cols)
-
2000:
G09411, G10123 (Knijff)
-
2001:
DYS441, DYS442 (Iida y cols)
-
2002: DYS443, DYS444, DYS445 (Iida y cols)
-
2002: DYS446, DYS447, DYS448, DYS449, DYS450, DYS452 - DYS459, DYS463, DYS464 (Redd y cols).
La herencia en bloque de estos
marcadores exige un análisis estadístico global, donde el conjunto de frecuencias
genéticas obtenidas constituye un haplotipo (Kayser y cols, 1997; pestoni y
cols 1998)
El proyecto terminó de
consolidarse en 1998 al crearse una base de datos para microsatélites del
Cromosoma Y (disponible por internet: http://ystr.charite.de)
buscando cuatro objetivos principales Roewer y cols, 2000):
-
Estandarizar el análisis de un haplotipo común de marcadores STRs
altamente informativo y de fácil detección electroforética.
-
Garantizar la estandarización en los resultados emitidos por los
distintos laboratorios mediante controles de calidad periódicos.
-
Determinar la estratificación de la población caucasoide en Europa.
- Recopilar una amplia base de datos que permita la estimación real de frecuencias haplotipicas para su aplicación en la práctica forense
Por otro lado, la búsqueda de polimorfismos específicos de la región no recombinante del cromosoma Y, ha llevado a la identificación de otros microsatélites tetranucleotídicos correspondientes a los GATA repeats (White y cols. 1999) y al menos veinte nuevos microsatélites al estudiar la secuencia de 1.33Mb de este cromosoma (Ayub y cols., 2000)
El tipado de un mayor número de marcadores polimórficos por muestra estudiada, aumenta de forma notoria el poder discriminativo y el potencial informativo de estos microsatélites (White y cols., 1999; ayub y cols., 2000)
1.5.7 QUE ADN SE ANALIZA?
- ADN cromosómico (genómico): ADN repetido en tandem o VNTR (acrónimo inglés por Variable Number of Tandem Repeats), que puede ser:
· Minisatélite o MVR (minisatellite variant repeats): secuencia de unas 30 pb (pares de bases).
· Microsatélite o STR (short tandem repeats): secuencia de 2 a 6 pb, normalmente 4. Por ejemplo, la secuencia ACTTACTTACTT ... ACTT puede aparecer repetida 8 veces en un locus y 12 veces en otro locus. Así, un individuo puede ser homocigoto 8-8, heterocigoto 8-12 u homocigoto 12-12.
- Polimorfismo del cromosoma Y: Se analizan microsatélites (STRs) y el polimorfismo de nucleótidos simples (SNPs).
-
ADN Mitocondrial (ADN mt):
Presenta herencia materna y es más estable que el ADN cromosómico. Se suelen
analizar dos regiones hipervariables del "lazo D".
1.5.8
TIPADO DE MARCADORES STR
El pequeño tamaño de los alelos STR (100-400 pb)
junto con los alelos minisatélites VNTR o Variable Number of
Tandem Repeats ( 400-1000 pb) hace de los
marcadores STR los mejores candidatos para el uso en aplicaciones forenses
donde el DNA degradado es común. Entre
varios tipos de sistemas STR, las repeticiones tetranucleótidos son más populares
que los di o trinucleótidos.
Las secuencias STR no solo varían en la longitud de la unidad de
repetición y el número de repeticiones, sino también en el rigor con que el
cual se ajustan a un patrón de repetición. Los STR están frecuentemente divididos
en varias categorías basadas en el
patrón de repetición. Las repeticiones simples contienen unidades
idénticas en longitud y secuencia, las repeticiones compuestas constan de dos o
más repeticiones simples adyacentes y las repeticiones complejas pueden
contener varios bloques de repeticiones de longitud variable además de
secuencias variables intermedias (Urquhart y cols; 1994). Las repeticiones
hipervariables complejas además contienen numerosos alelos no consensos que
difieren tanto en tamaño como en secuencia y son por lo tanto un desafío en el
genotipado reproducible (Urquhart y cols; 1993, Gill y cols; 1994). Esta última
categoría de marcadores STR no es comúnmente usada en el tipado en DNA forense
debido a las dificultades con la nomenclatura de los alelos y la medición de la
variabilidad entre laboratorios.
En el análisis de los marcadores STR existe un fenómeno biológico conocido como “stutter” el cual se produce durante la amplificación de los alelos STR. Los productos stutter (“tartamudos” en español) son causadas por deslizamiento de la enzima polimerasa en la amplificación del alelo STR a partir de la cadena molde. En la repetición tetramérica de loci STR la posición de una tartamuda corresponderá a una unidad de repetición completa más corta que la banda principal. Dependiendo del locus STR, el producto stutter puede ser tan grande como el 10% de la cantidad del producto del alelo en repeticiones tetranucleótidicas. Con di y trinucleótidos, el porcentaje stutter puede ser mucho mayor (30% o más), haciéndolo difícil de interpretar en las mezclas de muestras.
Además la extensión de la cuarta base en alelos tetranucleótidos hace el espacio más corto en heterocigotos y más fácil para resolver con la separación electroforética y sobre todo por su tamaño. Así, las ventajas de usar los loci tetranucleótidos en el tipado de DNA forense sobre minisatélites VNTR o las repeticiones di y trinucleótidos son:
1. Un rango reducido del tamaño de los alelos que permite la realización de reacciones multiplexes.
2. Un rango reducido en el tamaño de los alelos por lo que disminuye la amplificación preferencial de los alelos más pequeños.
3. La capacidad de generar productos PCR más pequeños que beneficia la obtención de información de especies con DNA degradado.
4. Disminución en la formación de productos stutter comparando con la repetición de dinucleótidos que beneficia la interpretación de muestras mixtas.
En la última década un número importante de
STR tetranucleótidos han sido aplicado en el campo de la identificación humana.
Los tipos de marcadores STR que se han buscado han incluido STR cortos para el
tipado de materiales con DNA degradado, STRs con bajo stutter característico para el análisis en mezclas, y
STR específicos de cromosoma Y para el análisis de mezclas hombre-mujer en
crímenes sexuales (Carracedo y cols; 1998). Los criterios de selección que se
utilizan para los loci STR aplicar en la identificación humana se han descrito
por Gill y cols; 1996.
- Elevado
poder de discriminación, siendo deseable que sea superior a un 90% de
heterocigosidad observada.
- Ubicación
cromosómica diferente, de tal manera que se evite la selección de loci
cercanos que puedan segregarse conjuntamente como un grupo de ligamiento.
- Facilidad
de análisis y alta reproducibilidad técnica y de resultados, en particular
para análisis múltiples de varios marcadores simultáneamente.
- Escasa
o nula tendencia a la producción de bandas tartamudas.
- Bajo
índice de mutación.
- Rango
de longitud alelica entre 90-500 pb ya que aquellos loci con alelos de
longitud no muy elevada son los que proporcionan en el análisis de ADN
degradado mejores resultados.
1.5.9 NOMENCLATURA PARA LOS ALELOS STR
De
acuerdo con la comisión de ADN de la ISFH (International Society of Forensic
Haemogenetics) se recomienda que en la denominación de los alelos STR se
realice según el número de UR completas de tal manera que cuando alguno tuviera
una UR incompleta se designará el número de UR completas y a continuación
separándolas por un punto el número de pares de bases (pb) de la UR incompleta.
Otras de las recomendaciones de la ISFH son las siguientes:
·
En los STR que están dentro de la región
que codifica proteinas (así como el intrón de los genes) se debe usar la hebra
codificante, esto se puede aplicar a STRs tales como VWA (GenBank; M25716),
TPOX (GenBank; M68651) y CSF1P0 (GenBank X14720).
·
Para secuencias repetitivas sin ninguna
conexión a genes que codifican proteínas como muchos de los loci D#S###, la
secuencia original descrita en la literatura de la primera base de datos
publicada será convertida en la referencia estándar de nomenclarura. Como
ejemplo se incluyen D18S51 (GenBank 18333) y D21S11 (GenBank M84567).
· Si la nomenclatura está ya establecida en el campo forense pero no conforme con lo ya mencionado, la nomenclatura será mantenida para evitar confusiones innecesarias. Esta recomendación se aplica al uso continuado de algunos laboratorios en la hebra de repetición “AATG” para el marcador STR TH01. La secuencia del GenBank para TH01 usa la hebra codificante y por tanto contiene en su lugar la repetición completa.
1.5.10 METODO DE EXTRACCIÓN DEL ADN.
1.- El ADN se puede extraer a partir de las células de una gran variedad de muestras:
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Células epiteliales de la mejilla, |
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Glóbulos blancos de la sangre |
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Folículos pilosos |
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Células fetales (provenientes de líquido amniótico) en cultivo |
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Semen |
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Otras. |
2.- HIBRIDACIÓN CON SONDAS.
Básicamente consiste en la identificación de una región determinada mediante el uso de una sonda, que es un fragmento monocatenario de ADN complementario a una secuencia de bases conocida. Esta sonda, marcada con un producto radiactivo o quimioluminescente, se pone en la solución con el ADN de la muestra y se visualiza después de una serie de procesos para separar los diferentes alelos que puedan existir con base en la longitud de los mismos.
3.- REACCIÓN EN
CADENA DE
La reacción en cadena de la polimerasa (conocida como PCR por sus siglas en inglés, Polymerase Chain Reaction) permite amplificar más de un millón de veces un ADN obtenido a partir de una región seleccionada del genoma, siempre y cuando se conozca una parte de su secuencia de nucleótidos. Esta técnica fue ideada en 1987 por Kary B. Mullis que obtuvo el premio Nobel de Química en 1993 por dicho invento.
El estudio de indicios biológicos por PCR ha permitido la resolución de un gran número de casos en Criminalística que hasta antes de su invento eran desestimados por no poseer la suficiente cantidad de muestra para su análisis.
Con el uso de la PCR muestras tan mínimas como pueden ser un pelo con raíz, una minúscula mancha de sangre o semen e incluso caspa son suficientes en muchos casos para llevar a cabo un análisis de identificación genética. La cantidad de ADN que se necesita está entre 20 y 100 ng., cantidad difícil de conseguir en casos criminalísticos, cuando los indicios biológicos encontrados son mínimos.
Su método requiere de cuatro componentes:
1. Dos cebadores o oligonucleotidos (oligo – pocos), cada uno de 15 a 20 bases de ADN. Corresponden a las secuencias de ADN inmediatamente adyacentes a la secuencia de interés.
2. DNA polimerasa. Efectúa el proceso fundamental de replicación del ADN. Dicha enzima se aísla de una bacteria termófila, denominada Thermus Aquáticus, que es capaz de crecer a temperaturas elevadas (79 - 85 º C). A esta temperatura dicha enzima es capaz de mantener una media de extensión de más de 60 nucleótidos por segundo en regiones ricas en uniones G-C. La temperatura optima a la que actúa la Taq polimerasa permite el uso de elevadas temperaturas para la unión de los primers y para la extensión de la hebra de ADN.
3. Un gran número de bases libres de ADN.
4. ADN genómico de un individuo en pequeña cantidad dada la extrema sensibilidad de la PCR.
La reacción se lleva a
cabo en una serie de ciclos cada uno de
los cuales incluye tres fases o pasos:
1. DESNATURALIZACIÓN: Para que comience la reacción es necesario que el ADN molde se encuentre en forma de cadena sencilla. Esto se consigue aplicando temperaturas de 90 a 95ºC que producen la rotura de los puentes de hidrógeno intercatenarios y por lo tanto la separación de ambas cadenas. Para conseguir la completa separación de las hebras de toda la muestra esta temperatura debe mantenerse unos minutos.
Si el ADN solo se desnaturaliza parcialmente éste tenderá a renaturalizarse rápidamente, evitando así una eficiente hibridación de los primers y una posterior extensión.
2. HIBRIDACIÓN: También denominada fase de “annealing”
o de emparejamiento. Una vez que el ADN está desnaturalizado se disminuye la
temperatura hasta un rango comprendido entre los 40 y los 60ºC para que se
pueda producir la unión de los primers a las secuencias flanqueantes del
fragmento que se va a amplificar. La temperatura de fusión o annealing (Tm,
“melting temperature”) depende de varios factores y es relativamente específica
para cada primer. La longitud de los primers y la secuencia son críticas en la
designación de los parámetros de una amplificación, una fórmula simple para calcular
la Tm es la siguiente:
Tm = 4(G+C) + 2 (A+T).
Sin embargo, cada primer exige una serie de estudios experimentales para determinar su temperatura de annealing específica ya que si la temperatura es muy baja la unión se hará de forma inespecífica y si es muy alta no se producirá una unión completa.
3. EXTENSIÓN: Durante esta fase la Taq polimerasa incorpora nucleótidos en
el extremo 3' del primer utilizando como molde la cadena de ADN previamente
desnaturalizada. La temperatura a la que se lleva a cabo este paso suele ser de
72ºC ya que es la temperatura a la que la Taq
polimerasa alcanza su máxima actividad. Normalmente una extensión de 20
segundos es suficiente para fragmentos menores de 500 pb, y 40 segundos para fragmentos por
encima de 1.2Kb.
El ADN recién sintetizado consta de un doble filamento que tiene la terminación 5´ del cebador en un extremo, seguido por las bases añadidas mediante la extensión del cebador por la ADN polimerasa y por último se calienta nuevamente el ADN de doble filamento hasta una temperatura elevada, provocando su desnaturalización y volviendo al iniciar un nuevo ciclo. A medida que los ciclos se repiten los productos de ADN ligados al cebador se amplifican de forma geométrica: el número de copias se dobla en cada ciclo (2, 4, 8, 16…)
Un factor importante en el transcurso de las diferentes fases es el tiempo de rampa. Este se define como el tiempo invertido en pasar de una temperatura a otra y depende del diseño y de las características del aparato donde se realiza automáticamente este proceso, el termociclador. En las nuevas generaciones de termocicladores este factor se ha ido optimizando para hacerlo mínimo.
Ventajas de la PCR:
- Utiliza cantidades muy pequeñas de ADN (nanogramos o picogramos)
- Una técnica de procedimientos rápidos Genera en un espacio corto de tiempo un elevado número de copias de la secuencia de ADN que es objeto de estudio.
- No necesita de sondas radiactivas para detectar mutaciones o secuencias de ADN específicas por generar grandes cantidades de ADN muy puro, pudiendo utilizar en su lugar sustancias marcadas no radiactivas, más seguras, como la biotina.
Tiene dos inconvenientes importantes:
- Se necesita del conocimiento de la secuencia de ADN que flanquea al ADN investigado para la síntesis del cebador.
- Muy susceptible para la contaminación en el laboratorio, por lo que deben tomarse cierto número de medidas protectoras que la impidan
4.- SECUENCIACIÓN.
Las técnicas de este grupo van destinadas a revelar el orden de la secuencia de bases de una determinada región, normalmente delimitada previamente por PCR. Puede hacerse de forma manual o automática.
Todo lo anterior nos lleva a destacar dos grandes aspectos de la investigación del ADN en Medicina Legal:
1.- Cuando se estudia el ADN no codificante, la información obtenida tras su análisis no aporta nada sobre ninguna de las características fenotípicas del individuo. No obstante, con las investigaciones del Proyecto Genoma Humano se descubrió que parte del ADN no codificante está relacionado con alguna característica fenotípica, bien de tipo fisiológico o bien patológico (enfermedades).
2.- Para identificación médico-forense, se necesita llevar a cabo una comparación entre el perfil genético obtenido del indicio o muestra y el genotipo de un individuo mediante la evidencia orgánica obtenida.
1.5.11 METODOS
DE SEPARACION DE DNA
1.5.11.1 Electroforesis:
Los productos PCR de DNA STR deben ser
separados de una manera que permita que cada alelo sea distinguido de otros
alelos. Los alelos heterocigotos son resueltos de un modo conocido como
electroforesis en el que la separación se basa en el tamaño. En términos
generales la separación puede ser en forma de un slabgel o un capilar.
La palabra “Electroforesis” viene del griego
electro (charge) y el latín phore (Beaver) , esta técnica se basa en la capacidad de las macromoléculas cargadas
para desplazarse en un campo eléctrico, con una velocidad proporcional a su
carga e inversamente proporcional a su tamaño. Las moléculas de DNA poseen,
normalmente un pH alcalino, una carga negativa uniforme por unidad de masa, lo
que hace que su movilidad hacia el ánodo (+) solo venga determinada por el
tamaño de la molécula (número de pares de bases, si es lineal). Los ácidos
nucleicos son ácidos porque los grupos fosfato ceden fácilmente sus iones H+ haciendo que ellos se carguen
negativamente en la mayoría del sistema buffer. Debe destacarse que los
cromosomas eucariotas son demasiado grandes para ser identificados por este
tipo de análisis, por lo que comúnmente se aplica sobre DNA fragmentado con
nucleasas (Luque..) El movimiento de iones en el campo eléctrico genera calor.
Este calor debe ser disipado o será absorbido por el sistema. Un exceso de
calor puede generar en el gel el efecto “banda sonrisa” o en casos extremos
puede llegar a fragmentar el gel.
ELECTROFORESIS CAPILAR
(CE)
La electroforesis capilar es una técnica relativamente novedosa en el campo de la Genética Forense pero que está poco a poco sustituyendo a los sistemas de electroforesis vertical. En este caso el proceso electroforético es llevado a cabo en un capilar de silica de unas 50 mm de diámetro, lo cual hace que la cantidad de calor generado sea menor y que puedan aplicarse voltajes mayores. Para que puedan ser analizados por electroforesis capilar los primers o los dideoxinucleótidos (en el caso de la secuenciación) deben ser marcados fluorescentemente con unas moléculas denominadas fluorocromos que emiten fluorescencia a una determinada longitud de onda cuando son excitados por láser. El equipo en el que se realiza el proceso lleva acoplado un ordenador encargado de traducir los datos de emisiones fluorescentes en secuencias o fragmentos con sus correspondientes alelos asignados.
La electroforesis capilar presenta una serie de ventajas frente a los sistemas de electroforesis vertical como son:
-
Rapidez: Permite el análisis simultáneo de varios loci aunque éstos posean alelos con tamaños
solapantes.
-
Sensibilidad: Hace posible detectar cantidades muy pequeñas de ADN amplificado. Los
resultados se obtienen de manera informatizada, lo que evita problemas de
interpretación de los resultados y facilita el análisis de los mismos a través
de programas informáticos.
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Gráfica No. 4. Ejemplo de un caso de criminalística resuelto utilizando electroforesis en gel vertical de acrilamida. Si se observan los patrones bandas podrá comprobarse como los perfiles obtenidos en las manchas de sangre encontradas en el sombrero (Hat) y pantalón (Jeans) del sospechoso (S) coinciden con el perfil genético de la víctima (V) |
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Gráfica No. 5. Caso de estudio biológico de la paternidad realizado con electroforesis capilar. Cada pico corresponde a un alelo, el hijo (H) debe poseer un alelo de la madre (M) y otro del padre (P) para que la paternidad sea compatible |
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Desventajas de la CE:
-
Una de las mayores desventajas de sus instrumentos
es su capacidad de procesamiento, debido
a que las muestras son analizadas de una en una, la instrumentación capilar
sola no es fácilmente capaz de procesar alto número de muestras o
procesamientos de muestras. Sin embargo los sistemas array capilares han sido
desarrollados para correr múltiples muestras en forma paralela y esos mejoran
enormemente el procesamiento de las muestras.
-
Los instrumentos de la electroforesis
capilar requieren un mayor costo (más de $50,000) que los sistemas de electroforesis
en gel y este hecho priva a algunos laboratorios de usarlos.
1.5.11.2 Futuras
tecnologías: biochips o microarrays.
Los biochips son una combinación entre técnicas microelectrónicas empleadas para la fabricación de microprocesadores informáticos y materiales biológicos. Su principal característica es su capacidad para generar información en muy poco espacio, por posibilitar el procesamiento de multitud de ensayos simultáneamente. Esta característica es la que hace que los biochips sean probablemente la tecnología del futuro en el campo de las investigaciones biomédicas.
La fabricación de los biochips es similar a la de los chips informáticos: por medio de la técnica denominada fotolitografía se depositan circuitos microscópicos sobre láminas de silicio. En el caso concreto de los biochips, estas láminas son de vidrio y lo que se deposita en dichas láminas son cadenas de ADN. Las láminas de vidrio presentan una serie de ventajas como son:
- Posibilidad de unir las cadenas de ADN a la superficie del cristal, convenientemente tratada, mediante enlaces covalente.
- Su capacidad para aguantar altas temperaturas y lavados de elevada fuerza iónica.
- Al ser un material no poroso el volumen de hibridación puede reducirse al mínimo.
- Su baja fluorescencia evita ruidos de fondo.
Estos chips consisten en una pequeña lámina de vidrio a los que se unirán los nucleótidos, protegidos mediante una película que posee unos grupos reactivos, realizada con un agente químico fotodegradable. Mediante una máscara que se sitúan sobre el chip, se logra enfocar un haz de luz hacia unas posiciones y regiones determinadas, degradando al agente químico protector en dichas zonas y dejándolo intacto en las zonas protegidas por la máscara. A continuación se añade al chip un medio que contiene uno de los cuatro nucleótidos que se unirá, mediante enlace covalente, al cristal con los grupos reactivos que hayan quedado desprotegidos. Cada grupo añadido lleva una molécula receptora fotodegradable.
Todo este proceso se va repitiendo con los diferentes nucleótidos y máscaras hasta generar unos oligonucleótidos con las secuencias de interés para su estudio.
El siguiente esquema trata de explicar todo el proceso mencionado anteriormente:
Gráfica No.6. Ejemplo de la Técnica biochips o microarrays para
obtener moléculas de ADN.
Cada “casilla” del chip posee una cadena de un oligonucleótido de manera que solamente aquel fragmento de ADN que hibride perfectamente con ella permanecerá unido tras los diversos lavados.
Previamente a la hibridación, el ADN de la muestra a estudiar debe haber sido amplificado y marcado fluorescentemente en uno de sus extremos. Una vez marcado se incuba en el recipiente que contiene al chip tras lo cual se lava varias veces para eliminar los fragmentos que no hayan hibridado y se introduce el chip en un escáner en el que se detectan los patrones de hibridación. Esta detección se realiza en base a la fluorescencia emitida por los fluorocromos de la muestra cuando son excitados por luz y en aquellos pocillos en los que la unión haya sido completa la fluorescencia será mayor que los que contengan alguna base desapareada.
Un ordenador conectado al escáner es el que identifica las secuencias sonda por su posición el chip. (Gráfica No.7)
1.5.12 MÉTODOS PARA
DETECCIÓN DE MOLÉCULAS DE ADN
Separadas las moléculas de ADN
normalmente se visualizan con el uso de distintos compuestos fluorescentes que se unen a ellas. Aunque el
más utilizado es el bromuro de etidio, va siendo sustituido por otros
fluorocromos con mayor poder de detección o menor toxicidad (Luque).
Técnicas tempranas incluían marcaje
radioactivo y autoradiografía. Estos métodos fueron sensibles y efectivos, pero
consumían tiempo. Además, el uso de radioisótopos era costoso debido a la
necesidad de las películas fotográficas y repuestos. En la última década
métodos tales como la tinción de plata y técnicas de fluorescencia han ganado
popularidad para detectar los alelos STR debido a su bajo costo en el caso de
la tinción de plata y su capacidad de automatización en la detección en el caso
de fluorescencia.
Selección del fluoróforo óptimo para
una aplicación determinada:
La selección del dye óptimo requiere la
consideración de las propiedades del espectro de los marcadores fluorescentes
en relación con las características del instrumento usado para la detección
(Singer y Johnson,1997). La intensidad de
la luz emitida por un fluoróforo es directamente dependiente de la
cantidad de luz que el tinte absorba.
Así, la fuente de estímulo es muy importante en el comportamiento del
fluoróforo. Otro importante parámetro a ser considerado incluye los filtros
ópticos usados para la discriminación de la señal y la sensibilidad y la
respuesta del espectro al detector.
Los lásers son una fuente efectiva de estimulación
porque la luz que emiten es muy intensa y en la adecuada longitud de onda. Dos
láseres son principalmente usados para estimular fluorescent dyes en el
espectro visible. El gas Argón produce luz a 488 nm y 514.5 nm. Este láser es
con mucho el más popular para diversas
aplicaciones incluyendo marcaje de DNA fluorescente porque puede ser usado con
más variedad de dyes que responden con su excitación. El otro láser que se
puede usar es el solid-state Nd: YAG que produce un haz de luz a 532 nm.
Una ventaja importante de los marcadores
fluorescentes sobre los otros métodos es la capacidad de registrar dos o
más fluoróforos por separado usando
filtros ópticos y un algoritmo de separación de fluoróforo conocido como
matrix. Con esta capacidad multicolor, los componentes de una mezcla compleja
pueden ser marcados individualmente e identificados separadamente en la misma
muestra.
1.5.13 Métodos para el marcaje de DNA:
El marcaje fluorescente de los productos PCR puede
ser realizado de tres formas:
1.
incorporando un tinte fluorescente dentro del amplicón a
través del primer de oligonucleótidos marcado en el extremo 5’;
2.
incorporando
desoxinucleótidos (dNTPs) marcados fluorescentemente dentro del producto PCR; e
3.
Intercalando un
fluorescent dye que se una al DNA (Mansield and Kronick 1993).
Cada método de marcaje de DNA tiene ventajas e
inconvenientes. El tercero de ellos puede ser usado seguido de la PCR y es
menos costoso que los otros dos métodos. Sin embargo, solo puede ser usado para
analizar fragmentos de DNA que se traducirán con un solo color, lo cual
significa que todas las moléculas deben ser susceptibles de ser separadas en
términos de tamaño. Por otro lado, los primer dye-labeled son populares debido
a que solo se marca una hebra del producto de PCR, lo cual simplifica la
interpretación de los datos porque la hebra de DNA complementaria no es visible
al detector. Los primer dyes labeled además permiten múltiples amplicones para
ser marcados simultáneamente de manera independiente.
La adición de un fluorescent dye a un fragmento de
DNA afecta a la movilidad electroforética de la molécula de DNA. Esto es debido
a que la forma y el tamaño físico del
dye cambia sobretodo el tamaño del conjugado dye-DNA. La carga iónica presente
en el dye, altera además la carga de la relación de tamaño del ácido nucleico
conjugado. Los fluorescent dyes que están covalentemente unidos a los primer
STR alteran la movilidad electroforética
de los alelos STR productos de PCR cuando se desplazan a través del gel o
capilar. Sin embargo, para solventar este problema existen una serie de
correcciones de software. Además, el genotipado de los alelos se realiza
siempre en relación con los laderes alélicos que son marcados con el mismo
fluorescent dye por lo que las diferencias de
movilidad no tendrán importancia para los alelos.
Silver Staining (tinción con plata):
La tinción con plata de geles de poliacrilamida ha
sido útil para detectar pequeñas cantidades de proteínas y visualizar ácidos
nucleicos. Tinciones que fueron usados en el primer kit comercial disponible de
Promega Corporation. Promega.
Aunque su uso cayó en lo obsoleto son bastante
efectivos para algunos laboratorios que quieren realizar un tipado de DNA a
bajo costo, por no requerir instrumentos costosos, solamente una caja o estuche
del gel para electroforesis y un poco de nitrato de plata y la preparación de
otros reactivos.
El procedimiento de tinción con plata es realizado
transfiriendo el gel entre placas llenadas con varias soluciones que exponen
las bandas de DNA con una serie de reactivos para propósitos de tinción (Bassam
et al 1991). Primero el gel es sumergido en una solución de nitrato de plata al
0.2%. La plata se une al DNA y es reducida con formaldehido para formar un
depósito de plata metálica sobre las moléculas de DNA en el gel. Se toma
entonces una fotografía del gel para capturar la imagen de las hebras de DNA
teñidas con plata y mantener un registro permanente del gel.
Ventajas y desventajas de la tinción
con plata
-
Es menos
peligrosa que los métodos de detección radioactiva, aunque no tan conveniente
como los métodos de fluorescencia.
-
La mayoría de
reactivos para la tinción con plata son inocuos y no requieren precauciones
especiales para su manejo.
-
La principal ventaja lo representa ser el de
una técnica es barata. La preparación de los reactivos está fácilmente disponible
a bajo costo.
-
Los productos PCR no necesitan ningún marcaje especial, tal como
los dyes fluorescentes.
-
La tinción puede ser completada en una hora y
media y con un número mínimo de pasos.
-
La sensibilidad
es 100 veces mayor que la obtenida con la tinción con bromuro de etidio (Merril
et al, 1998).
-
Sin embargo una de las grandes desventajas
para la interpretación de los datos es la detección de ambas hebras de DNA en
un medio desnaturalizante; se revelan las dos bandas por cada alelo. Además,
solo existe un “color”, lo que hace que sean las diferencias de tamaño en los
productos PCR el único método utilizado para marcadores STR multiplex.
1.5.14 METODOS DE ANÁLISIS DE LOS STRs.
Para la
década de los setenta, los laboratorios inician la secuenciación del ADN
mediante procedimientos manuales en geles de acrilamida; y para los noventa se
generalizan las técnicas semiautomatizadas de secuenciación, aportando
múltiples ventajas al tipado de estos marcadores.
Los productos de la PCR marcados con
fluorocromos pueden ser detectados en tiempo real mediante electroforesis en
geles de poliacrilamida y lectura de los resultados con escáner de
fluorescencia (Schumm y cols, 1994). Aunque la electroforesis capilar es el
sistema que ofrece mayor precisión en la lectura (Mansfield y cols, 1998)
actualmente se prefiere utilizar secuenciadores simiautomáticos (Gill y cols, 1995; Moscetty cols, 1995) que
facilitan al investigador la interpretación de un mayor número de muestras en
cada prueba. Las ventajas de este tipo de análisis en relación con los sistemas
de tipado manual son entre otras:
1.
Los sistemas semiautomáticos detectan
solamente una de las dos cadenas del fragmento de ADN amplificado, por
encontrarse marcado solo uno de los sebadores.
2.
El marcador externo de peso molecular
permite medir de manera automática, el tamaño de los alelos. Además que, con la
incorporación de un estándar o marcador interno de peso molecular junto a cada
muestra se eliminan las diferencias de movilidad electroforética que pueden
existir en las diferentes calles de un gel (ISFH, 1994; Gill y cols, 1995)
3.
Es posible que con la utilización de
diferentes fluorocromos permita el análisis simultáneo de varios loci marcados,
a pesar de que estos se solapen por el tamaño de sus alelos. Ventaja solo
aprovechada para algunos secuenciadores del mercado (Perkin Elmer®) (Mansfield y cols, 1998)
4.
Obtención
informatizada del tamaño de los fragmentos y la designación alélica, lo que
evita errores de transcripción y reduce el tiempo de análisis.
Los resultados pueden ser interpretados con
distintos programas que determinan la longitud de los fragmentos y realizan la
designación automática de los alelos (ALFwinFragment Analyser 1.00, Amersham
Pharmacia Biotech; GeneScan 672 Software y Genotyper, Perkin Elmer Applied
Biosystems División) obteniendo así el perfil genético de cada muestra (Gill y cols, 1995; Schumm, 1997)
El
análisis de secuencias o fragmentos de ADN por medio de chips se basa en la
síntesis de distintas sondas de oligonucleótidos, su alineación en
disposiciones ordenadas (arrays) y su unión a un soporte consistente en una
fina pastilla de nylon o vidrio. Este chip se prueba frente a un ADN marcado
fluorescentemente haciendo que el patrón y la cantidad de fluorescencia suministren
información sobre la secuencia del ADN en estudio.
La
última generación de este enfoque es la combinación de técnicas
fotolitográficas (chips de silicio para computadoras) con síntesis química en
fase sólida, que logra chips con ordenaciones de decenas e incluso centenares
de miles de oligonucleótidos distintos que pueden identificar secuencias
marcadas fluorescentemente en pocos minutos, por medio de un microscopio con
focal de fluorescencia totalmente automatizado que registra los datos (Syvanen,
1999). Es muy probable que el análisis forense de ADN nuclear y mitocondrial,
también pueda efectuarse utilizando en un futuro estas mismas técnicas.
1.5.14.1
ANÁLISIS MULTIPLEX
Este análisis
permite combinar en una única reacción, todos los pares de primers de los
sistemas que se quieren amplificar simultáneamente junto con el resto de los
reactivos de la reacción en cantidades suficientes.
Ventajas
del Análisis Multiplex:
1.
Obtención de la información de varios loci
en una sola reacción.
2.
Menor cantidad de templado para el
análisis.
3.
Tiempo de Análisis disminuido
4.
Rápida formación de bases de datos.
Inconvenientes
del Sistema de Análisis Multiplex:
1.
Aparición de “artefactos” que interfieren
la buena interpretación de los resultados y por tanto en el genotipado de los
alelos del ADN modelo. En este tipo de análisis su probabilidad es mayor, por
lo que se debe tenerse en cuenta la necesidad de variación y optimización de
algunos de los parámetros: condiciones cíclicas de la reacción y sus
componentes para tratar de lograr un rendimiento equilibrado en la
amplificación simultánea de los loci escogidos.
2.
Algunos artefactos que se pueden lograr,
incluyendo en condiciones de análisis uniplex:
a.
Amplificaciones inespecíficas, tales como:
-
Bandas tartamudas o “stutter”.
-
Artefactos inespecíficos.
- “Pull up”
- Bandas N y
N+1
b.
Amplificación
preferencial de algunos loci.
c.
Inhibición de la
Amplificación por formación de dímeros de primers.
AMPLIFICACIONES
INESPECÍFICAS:
-
Bandas
Tartamudas o “stutter”.- Productos alélicos que se diferencias estructuralmente
del alelo asociado, tan solo por una unidad de repetición (Gill, 2003)
En un electroferograma, se caracteriza por
presencia de picos más pequeños que el pico del alelo STR. Ha sido referido al
deslizamiento de la enzima polimerasa durante la amplificación de la cadena
molde (Hauge y Litt, 1993; Walsh y cols, 1996). Generalmente aparecen en
parejas; sin embargo no es un dato patognomónico ya que si un alelo tiene
secuencias no consenso o parciales, entonces será más proclive a generar bandas
tartamudas que el alelo que consista de repeticiones completas (Walsh y cols,
1996).
Otras características descritas por Butler (2001)
son:
a-
Representan
menos del 10% del peso del pico del alelo principal.
b-
La cantidad de
stutter depende de las condiciones PCR y de la enzima polimerasa utilizada.
c-
Su formación
tiende a disminuir con la unidades de repetición más largas (repeticiones
pentanucleótidos, tetra, tri y dinucleotidos.
d-
Sus cantidades
son mayores para los alelos más grandes dentro del locus.
e-
La cantidad de
stutter es menor si la secuencia de repeticiones es imperfecta.
-
Artefactos no
Específicos.- Son generados como resultados de la hibridación de fragmentos de
ADN degradado o bacteriano (Gill, 2003); tienden a migrar de forma atípica dentro
del gel. Corresponden a picos de pequeño tamaño, caracterizados por:
a.
Tienen el área
del pico baja y su morfología es aberrante.
b.
Se relacionan
con la hibridación del primer en otro sitio del genoma
c.
La mayoría no
están dentro del rango alélico del locus.
-
Pull up.- picos
debidos a interacciones hardwar/matriz, definido como un pico menor con un color diferente y directamente por
debajo de un pico alélico mayor, o picos
pequeños en las calles adyacentes a un pico grande exactamente en la misma
posición. Se han observado comúnmente en muestras sobreamplificadas y necesitan
ser diferenciados de los alelos verdaderos por medio de posición y morfología
del pico.
-
Bandas “N” y
“N+1”.- La señal del alelo verdadero es conocida como pico “N”. La adicción de
una base extra por la enzima polimerasa al final del paso de elongación puede
producir un producto PCR una base más PCR una base más larga que la longitud
del alelo verdadero y esto es el llamado pico “N+1” (Sparkes y cols, 1996)
AMPLIFICACIÓN
PREFERENCIAL DE ALGUNOS LOCI.- Generalmente
dentro de cualquier locus STR, un alelo de bajo peso molecular amplificará con
más eficiencia que uno de mayor peso molecular (Whitaker y cols, 1995, 1995;
Clayton y cols, 1998)
INHIBICIÓN
DE LA DE LA AMPLIFICACION por formación
de dímeros de primers, ya que en una reacción multiplex, el número de primers
aumenta y con ello el número de interacciones posibles, disminuyendo así el
rendimiento de la amplificación y aumento de la probabilidad de aparición de
artefactos inespecíficos. (Whitaker y cols. 1995; Clayton y cols, 1998; Gill, 2003)
1.5.15 STR DE CROMOSOMA Y OBJETO DE ESTUDIO
El cromosoma Y muestra una cantidad y variedad
extraordinaria de ADN repetitivo probablemente como consecuencia de la carencia
de recombinación intercromosómica a través del tiempo (Kittler y cols). La
herencia exclusivamente paterna de la región no recombinante del Cromosoma Y es
la característica principal que traduce el mantenimiento de las generaciones
polimórficas ligadas al sexo que pueden ser utilizados para reconstruir la
evolución de los linajes paternos.
Es así,
como los STR de Cromosoma Y se han convertido en un elemento de gran valor en el estudio de muchos casos forenses.
Ejemplo de ello lo es en los casos de violación, en la investigación biológica
de la paternidad de hijos varones lo que permite investigar a cualquier
pariente masculino del presunto padre y comprobar si su haplotipo de cromosoma
Y es coincidente; por otro lado su utilidad es de vital importancia en la
investigación de la identidad y sexo en casos de desastres en masa.
La tabla
siguiente reúne algunas características de los loci STRs del cromosoma Y más
utilizados en Medicina Legal:
Tabla
No. 2. Resumen de características STRs
de Cromosoma Y
|
Locus |
Unidad de Repetición |
No. De Repeticiones
|
Tamaño de los alelos |
No. Alelos observados. |
DYS19
|
(GATA)n |
10
– 19 |
174
- 210 |
10 |
|
DYS385 |
(GAAA) |
10
–22 |
252
- 300 |
13 |
|
DYS388 |
(ATA) |
11
– 17 |
125
- 143 |
7 |
|
DYS389
I |
(GATA)n
(GACA)n |
9 – 17 |
235 - 267 |
9 |
|
DYS389 II |
(GATA)n (GACA)n |
26 – 34 |
355 - 387 |
9 |
|
DYS390 |
(GATA)n (GACA)n |
18
– 28 |
191
- 231 |
11 |
|
DYS392 |
(ATT)n |
7/10
– 17 |
236/245 - 266 |
9 |
|
DYS393 |
(GATA)n |
9 - 15 |
108 - 132 |
7 |
*Kayser et al. and de Knijff et al. 1997; Schneider et al. 1998
q DYS19 (Roewer y cols, 1992)
Identificado por la repetición del tetranucleotido
(GATA). El estudio de su secuencia permitió difinir la estructura: (CTAT/C)n.
Se localiza en el brazo corto del Cromosoma Y; su tamaño oscila entre 174 y 210
pb y entre 10 y 19 repeticiones (Knijff y cols, 1997).
q DYS385 (Schneider y cols, 1998 - 1999)
Su secuencia descrita (GAAA)n aparece entre 10 y 22
veces, con un rango de 364 a 412 pb. Durante su estudio se logran describir
fragmentos más pequeños al realizar una modificación en la secuencia del
cebador no marcado (252 a 300 pb). Su baja tasa de mutación y la escasa
ambigüedad que presenta en la asignación alélica lo convierten en marcador de
elección con respecto al resto de STRs con una doble localización en el
cromosoma Y.
q DYS388 (Kayser y cols, 1997)
Microsatélite simple, trinucleotídico (ATA)
repetido entre 11 y 17 veces. Da lugar a la formación de fragmentos de 125 a
143 pb. Fue descrito por Keka y cols en 1996
pero la escasa diversidad genética que presentó en los primeros estudios
poblacionales hizo que no se recomendara como marcador de rutina en genética
forense; razón por la que no se incluye dentro del haplotipo mínimo recomendado
para la base de datos con fines forenses que se ha elaborado para el cromosoma
Y (Roewer y cols, 2000).
q DYS389 (Kayser y cols, 1997)
La duplicación en el sitio de unión de unos de los
cebadores de este microsatélite permite el análisis de dos fragmentos de ADN
diferentes, según el número de repeticiones de cuatro bloques de
tetranucleótidos (TCTG) y (TCTA). El fragmento I es un STR simple de 239 a 263
pb. y se engloba dentro del DYS389 II que tiene la estructura de un
microsatélite compuesto (Junge y Madea, 1999)
La nomenclatura utilizada está descrita por Roewer
y cols, 2000. A diferencia del STR DYS385, el desigual rango de pares de bases
permite en este caso una asignación alélica independiente. Su estudio muestra
diferencias significativas entre poblaciones (Rolf y cols, 1998) lo que prueba
ser útil en medicina forense.
q DYS390 (Kayser y cols, 1997)
STR compuesto cuyas variantes alélicas han puesto
de manifiesto diferencias de estructura en sus repeticiones (CTG/AT) con alelos
del mismo tamaño y distinta secuencia nucleotídica (Pestoni y cols, 1998; Junge
y Madea, 1999)
Sus secuencias tetranucleotídicas se repiten entre
18 y 27 veces, formando al menos 10 alelos cuyos tamaños oscilan entre 191 a
227 pb. Este marcador presenta un patrón mutacional distinto al resto de STRs
del cromsoma Y (Forster y cols, 1998). Su valoración es fundamental tanto para fines antropológicos como para
peritaciones forenses en la identificación de la paternidad (Lessig y Edelman,
1998)
q DYS392 (Kayser y cols, 1997)
Su repetición trinucleótida (ATT) entre 7 y 16
veces y su nucleótidos flanqueantes
forman fragmentos PCR con un rango de
236 a 263 pb. En algunos estudios poblacionales se han descrito 8 variantes
alélicas para este microsatélite simple (de Kniff y cols 1997; Kayser y cols,
1997)
q DYS393 (Kayser y cols, 1997)
Presenta al menos 6 alelos por la repetición del
tándem (GATA)n de 9 a 15 veces, formando fragmentos de pequeño tamaño (108 a
132 pb) (de Kniff y cols, 1997). Estudios poblacionales han dado lugar a la
identificación de nuevos alelos, como el alelo 16 en el trabajo de Pawlowski y
cols, 1999)
Su estructura sencilla y su fácil lectura
electroforética lo hacen un marcador
interesante en estudios de identificación, formando parte del haplotipo mínimo
recomendado internacionalmente (Roewer y cols, 2000)
q GATA A7.1 (White Y Cols, 1999)
STR simple (ATAG)n. El tamaño de sus alelos se
comprende entre 109 y 129 pb y de 7 a 12 alelos
q GATA A7.2 (White Y
Cols, 1999)
Posee bloques de repeticiones (TAGA)n. Presenta de
10 a 14 repeticiones y su tamaño oscila entre 148 y 168 pb.
q GATA A10 (White Y Cols, 1999)
Presenta repeticiones alélicas entre 11 y 18 y su
tamaño es de 150 a 174 pb. Posee varias regiones constantes repetitivas y un
solo tramo variable (TACT)n.
q GATA C4 (White Y Cols, 1999)
Repetición compleja. Se describen dos subtipos para
este sistema cuya diferencia está en la inserción de un (TGTA)² en medio de la
región variable (TCTA)n. Su tamaño esta comprendido entre 246 y 274 pb (20 –25
alelos). Dos nuevos alelos (19 y 20) fueron descritos por Beleza y cols, 2003
en un estudio poblacional portuguesa.
q GATA H4 (White y Cols, 1999)
Posee varios tramos repetitivos constantes pero
solo una región repetitiva variable (ATAG)n. Su estructura fue descrita de
forma diferente por White y cols, 1999 y no concuerda con la del GenBank ni con
la descrita por González – Neira y cols, 2001. Presenta alelos que poseen de 25
a 29 repeticiones y su tamaño está comprendido entre 272 y 288 pb.
Beleza y cols, 2003, refieren el hallazgo de un
nuevo alelo (30) en una población portuguesa.
q DYS437 (Ayub y cols, 2000)
Repetición tetranucleotídica compleja con un alto
grado de polimorfismo y elevado poder discriminativo. El tamaño de sus alelos
está comprendido entre 180 y 196 pb (13 a 17 alelos).
González – Neira y cols, 2001, describen dos
subtipos con diferentes secuencias. El tipo A (TCTA)n (TCTG)2 (TCTA)4 ... (TCTA)2 descrita en todos los grupos poblacionales; y el tipo B (TCTA)n (TCTG)1
(TCTA)4 ... (TCTA)2 solo encontrada en población asiática.
q DYS438 (Ayub y cols, 2000)
Repetición pentanucleotídica (TTTTC) altamente
variable y por lo tanto uno de los más útiles en el campo forense. Tiene de 6 a
13 repeticiones y su tamaño está comprendido entre 201 y 236 pb.
q DYS439 (Ayub y cols, 2000)
Repetición compleja altamente variable al igual
DYS437 y DYS438. Se representa como (GATA)2 N4 (GATA)3 N14 (GATA) N3 (GATA) N7 (GATA)13.
El tamaño de sus alelos está comprendido entre 238
y 258 pb (9 – 14 alelos)
q GATA A4 (White y cols, 1999)
Este tetranucleótido posee de 19 a 22 repeticiones
y el tamaño de sus alelos está entre 239 – 251 pb. GATA A4 Y DYS439 se piensa
que son el mismo STR por tener igual estructura e iguales alelos y la única
diferencia radica en el diseño del primer.
q DYS434 (Ayub y cols, 2000)
Posee un nivel intermedio de variabilidad (Hou y
cols, 2001). Sus alelos están comprendidos entre 110 y 122 pb; presentando de 8
a 11 repeticiones.
q DYS435 (Ayub y cols, 2000)
Repetición tetranucleótida (TGGA)n...(AGAT)2... (ATAG)2. Al igual que el locus DYS434 posee nivel de variación
intermedia. El tamaño de sus alelos es de 218 – 226 pb y de 15 a 17 alelos.
q DYS436 (Ayub y cols, 2000)
Repetición trinucleotida GTT de baja variabilidad.
Sus alelos son de 10 a 15 repeticiones y cuyos tamaños oscilan entre 128 – 143
pb. Junto a los dos marcadores anteriores no se recomienda para fines forenses
dada su baja variabilidad (Mohyuddin y cols, 2001; Bosch y cols, 2002)
Otros STRs de Cromosoma Y, se resumen en la tabla
siguiente:
Tabla
No. 3
Resumen, características STRs, Cromosoma Y descritos por White y cols,
(1999) y Ayub y cols, 2000.
|
Locus |
Unidad de Repetición |
Alelos |
Nº de Alelos |
Tamaño (pb) |
|
DYS434 |
CTAT |
8
– 11 |
4 |
110
– 122 |
|
DYS435 |
TGGA |
15
– 17 |
3 |
218
– 226 |
|
DYS436 |
GTT |
10
– 15 |
6 |
128
- 143 |
|
DYS437 |
(TCTA)m (TCTG)n (TCTA)4 |
13 – 17 |
5 |
180 - 196 |
|
DYS438 |
(TTTTC)1 (TTTTA)0,1 (TTTTc)n |
6 – 13 |
8 |
201 - 236 |
|
DYS439 |
(GATA)n |
9 – 14 |
6 |
236 - 256 |
|
GATA A7.1 |
(ATAG)n |
7/9 – 12 |
5 |
109/117 - 129 |
|
GAGA A7.2 |
(TAGA)n(CAGA)1 |
10 – 14 |
5 |
148
- 168 |
|
GATA A4 |
(AGAT)n |
19 - 22 |
4 |
239 - 251 |
|
GATA A10 |
(TCCA)2(TATC)n |
11 - 18 |
8 |
150 - 174 |
|
GATA C4 |
(TCTA)2[(TCTA)2(TGTA)2]2,3(TCTA)n |
20
-25 |
6 |
246
- 274 |
|
GATA H4 |
(AGAT)4CTAT(AGAT)2(AGGT)3(AGAT)Nn2(ATAG)4(ATAC)1
(ATAG)24 |
25 - 29 |
5 |
272 - 288 |
*Gusmão y cols, 2001; Ayub y cols, 2000; White y cols, 1999
1.5.16 OTROS
MICROSATÉLITES DE CROMOSOMA Y:
Otros STRs
del Cromosoma Y incluyen ocho repeticiones tetranucleotídicas, cinco
pentanucleotidos y una repetición hexanucleotídica (Redd y cols, 2002). Dos de
ellos (DYS459 y el DYS464) producen varios productos: el primero produce 1 ó 2;
mientras el segundo de 1 a 4 picos, respectivamente.
El DYS446,
DYS450, DYS453 – DYS456; DYS458, DYS459 y el DYS464 son de categorías STRs simples (Urquhart y
cols, 1994); mientras el DYS447, DYS452 y
el DYS463 son clasificados como repeticiones compuestas. Los STRs DYS448
y DYS449 muestran una estructura más compleja; otros, como los DYS452 y DYS447,
muestran variantes como delección o transición. Todos estos STRs proporcionan
poder adicional para resolver haplotipos del cromosoma Y, siendo los de
unidades de repetición más larga los más útiles para una mejor interpretación
en casos de mezclas de muestras (Gill y cols, 1998b; Clayton y cols, 1998). Por
otro lado, muestran una disminución en el porcentaje de productos stutter (las
repeticiones tetranucleotidas muestran aproximadamente un 15% y en repeticiones
pentanucleotídicas pueden ser de 1 a 2 %; Butler, 2001)
1.6. DISEÑO METODOLOGICO
TIPO DE ESTUDIO:- Explorativo, según su objetivo; Transversal, según su orientación en el tiempo; y de Laboratorio, según el marco en que tiene lugar. Este estudio retoma los resultados obtenidos de la extracción de ADN, utilizando algunos marcadores genéticos de Cromosoma Y, llevado a cabo en el Laboratorio de Genética Forense de la Facultad de Medicina de la Universidad de Zaragoza, España, entre los meses de Agosto 2002 y Agosto 2003.
UNIVERSO: 158 muestras sanguíneas en forma de manchas tomadas de individuos masculinos, adultos, sanos, no emparentados entre sí, de diversas partes geográficas de la población de Nicaragua, durante los meses de Julio y Agosto del año 2002.
METODOS Y TÉCNICAS: Las muestras se obtuvieron al azar simple, mediante punción venosa periférica, formando manchas directas sobre papel filtro especial (FTA) dejándose secar a temperatura ambiente y archivándose hasta su procesamiento en el Laboratorio de Genética Forense de la Facultad de Medicina; Universidad de Zaragoza, España.
La extracción de ADN se llevó a cabo utilizando el siguiente procedimiento:
a. Utilización de papel filtro especial FTA (FTA matriz card, Whatman Biosciencie, Fitzco Inc, USA).
La tecnología FTA es una herramienta revolucionaria que ha sido optimizada para la colección, purificación y análisis de ADN obtenido de fuentes biológicas como sangre completa, raspados bucales, plasmidos, tejidos y microorganismos. Los productos FTA están compuestos de una sofisticada matriz de filtración impregnada con una fórmula patentada de proteínas desnaturalizantes, un agente quelante y un atrapador de radicales libres, diseñados para proteger y captar ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos permanecen inmovilizados dentro de la matriz durante la purificación, eliminando el potencial cruce de contaminación entre muestras almacenadas y procesadas en la misma matriz de FTA. Su ventaja es que previenen la degradación de ADN y se pueden almacenar a temperatura ambiente.
b.- Se realizaron cortes de papel FTA en tamaños de 2 mm cuadrados, aplicados sobre tubos eppendorf de 1.5 ml.
c.- Utilización de Kit de extracción de ADN Ready Amp Genomic DNA Purification System (Promega Corporation, Madison, USA). Un sistema de extracción por medio del cual se obtiene el ADN genómico en una forma simple, efectiva, segura y económica a partir de sangre o manchas de sangre para su posterior amplificación sin cualquier otra manipulación.
d.- Materiales
y reactivos:
q Kit de extracción ReadyAmp Genomic
DNA Purification System
q Baño a Temperatura 56° C
q Baño a Temperatura 100°C.
e.- Protocolo de Extracción:
1.
Transferir 1 ml de agua libre de nucleasas dentro del tubo de 1.5 ml.
2.
Añadir un trozo de 9 – 25 mm cuadrados de la mancha de sangre al tubo.
3.
Incubar a temperatura ambiente por 10 minutos, vortex cada 1 – 2
minutos durante la incubación.
4.
Centrifugar la muestra a 15,000 rpm por 2 min. a temperatura ambiente.
5.
Remover y descartar el sobrenadante. Dejar la mancha de sangre en el
tubo con el pellet.
6.
Agregar 200 µl de resina resuspendida a cada muestra.
7.
Vortex la muestra para resuspender el pellet (hasta que el pellet
completo ha sido resuspendido).
8.
Incubar la muestra por 20 min. en un baño a 56° C.
9.
Vortex a alta velocidad de 5 – 10 segundos.
10.
Centrifugar la muestra a 15,000 rpm por 2 minutos a temperatura
ambiente.
11.
Almacenar el ADN extraído a 4° C hasta su amplificación.
f.- Cuantificación del ADN por
espectrofotometría. La cantidad y la pureza del ADN fue calculada en un
espectrofotometro Gene Quant II DNA/RNA Calculator® de Pharmacia. Para estimar
la concentración de ADN se preparó una dilución 1/50 de la muestra problema,
depositando 30µg de la muestra en 1,470 µl de agua desionizada autoclavada,
para dar una concentración aproximada de 50 µg/ml de la muestra problema.
Las bases purínicas y pirimidínicas absorben
fuertemente la luz ultravioleta a 260 nm, de modo que una solución de ADN de
doble cadena con una concentración a 50 µg/ml presenta una densidad óptica (OD)
de 1 cuando se mide su absorbancia a 260 nm. El cociente entre las absorbancias
a 260 y a 280 nm proporciona una
estimación de pureza de ADN obtenido. El valor de absorbancia a 260 nm equivale
a una concentración de doble cadena de 50 µg/ml.
La cantidad total de ADN a analizar se
obtiene mediante el producto de la concentración por el volumen total de la
muestra cuantificada, dato que a partir del cual podemos calcular la
concentración de ADN en la muestra problema. La concentración de la muestra se
calcula según la siguiente relación:
[ADN µg/µl] = (Abs 260 nm) x (50µg/µl)
x (50/1) x (1 ml/1000µl)
[ADN
µg/µl] = (Abs 260 nm) x 2.5 µg/µl
Para conocer la pureza del AND extraído, se
calcula la relación:
R =
(Abs 260 ) / (Abs 280). El valor resultante indica si el
AND de la muestra extraída está purificado o no. Valores de 280 nm indican la
presencia de restos proteicos presentes. Una buena pureza proporciona valores R
entre 1.8 y 2.0. En caso de contaminación con fenol o con proteínas, éste será
mucho mayor.
g.- Amplificación del ADN in vitro por PCR
(Reacción en Cadena de la Polimerasa). Se analizaron los siguientes
microsatélites de Cromosoma Y: DYS19 (Uniplex); GEPY II (Multiplex) (GATA A7.1,
DYS439, GATA H4 Y GATA A10); los que fueron amplificados en PCR únicas y
múltiples en un termociclador programable (Gene Amp System 2400 Thermal Cicler,
Perkin Elmer®, Norwalk, Cont, EEUU); utilizando sus reactivos respectivos y
ciertas condiciones de amplificación específicas para cada tipo (Uniplex –
Multiplex)
Los parámetros de amplificación varían para
cada sistema de acuerdo a la secuencia de los cebadores.
Reactivos para PCR en estudio de
Microsatélites de Cromosoma Y:
-
2.5
µl tampón 10X Thermophilic Buffer conteniendo 500mM KCl (pH 9.0 a 25°C), 1%
triton X-100.
-
2 µl MgCl², 25 mM
-
1 µl de cebadores (P1 y p2) a la concentración especificada.
-
4 µl de dNTPs (Pharmacia®) 200 µm: dATP, dGTP, dCTP, dTTP 100 Mm,
preparándose alícuotas de 5 µl para cada dNTP y se añade 380 µl de agua
desionizada.
-
Taq ADN Polimerasa: Thermus Aquaticus Strain YTL, a una concentración
de 5,000 U/ml .
-
2 µl de la solución de ADN extraído
-
Agua hasta un volumen final de 25 µl.
Primers o cebadores: La secuencia y sus
condiciones de amplificación son específicas para cada marcador, cuya
visualización solo es posible en el secuenciador automático ALF Express
(Pharmacia®) gracias al programa de análisis de fragmentos.
-
DYS19 (Roewer y cols, 1992)
concentración final
P1: *5´ CTA CTH AGT TTC TGT TAT AGT
3´ 0,5 µM
P2:
5´ ATG GCA TGT AGT GAG GAC A
3´ 0.5 µM
Taq AND Polimerasa 2 U
|
Programa
de Termociclaje |
|
|
Inicio: |
94°C, 1 min |
|
30 ciclos: |
94°C, 20 seg |
|
|
55°C, 20 seg. |
|
|
72°C, 20 seg. |
|
Final: |
72°C, 2 min. |
ANÁLISIS MULTIPLEX DE MICROSATÉLITES STRs DE CROMOSOMA Y (GEPY II):
- Reactivos:
-
1X
GeneAmp 10X PCR Buffer: 100mM Tris-HCl,
pH 8,3; 500mMKCl
-
2 mM MgCl2 (25mM)
-
2 µl de mix primer (dilución de acuerdo a la concentración final de
cada uno)
-
200 mM dNTPs (Pharmacia®) 200 µm: dATP, dGTP, dCTP, dTTP 100 mM, Se
preparan alícuotas de 5 µl para cada dNTP y se añade 380 µl de agua
desionizada.
-
0.5 U de AmpliTaq Gold Polimerasa
-
2 µl de la solución de ADN extraído
-
Agua hasta un volumen final de 25 µl.
Condiciones de Amplificación |
|
|
Pre-Incubación: |
95°C,
11 min. |
|
32 ciclos: |
94° C, 30 seg. |
|
|
60° C, 20 seg. |
|
|
70° C, 30 seg. |
|
Incubación final: |
70°
C, 45 min. |
A continuación se resume en una tabla la secuencia de los primers utilizados en el sistema multiplex analizado y la concentración final de cada uno de ellos. (Tabla No. 5)
|
GEPY II |
|
|
|
Primers |
Secuencia
del Primer (5´- 3´) |
Concentración final |
|
AGC AAG CAC AAG AAT ACC AGA G (3) |
0,16 M |
|
|
GATA A7.1 -
R |
TCT ATC CTC TGC CTA TCA TTT ATT A (2) |
0,16 M |
|
GATA A10 -
F |
CCT GCC ATC TCT ATT TAT CTT GCA TAT A (2) |
0,20 M |
|
GATA A10 -
R |
ATA AAT GGA GAT AGT GGG TGG ATT (2) |
0,20 M |
|
DYS439 - F |
TCC TGA ATG GTA CTT CCT AGG TTT (1) |
0,20 M |
|
DYS439 - R |
GCC TGG CTT GGA ATT CTT TT (1) |
0,20 M |
|
GATA H4 - F |
GTT ATG CTG AGG AGA ATT TCC AA (3) |
0,24 M |
|
GATA H4 - R |
CCT CTG ATG GTG AAG TAA TGG AAT TAG A (2) |
0,24 M |
- Ayub y cols, 2000 (1); White y cols, 1999 (2); Gusmao y cols, 2001 (3)
h.- Detección automática de fragmentos marcados
con fluoresceína: Los productos PCR fueron detectados en tiempo real mediante
electroforesis en geles de poliacrilamida en un secuenciador automático de ADN
(ALF DNA Sequencer, Pharmacia Biotech®, Uppsala, Suecia). El sistema mide y
cuantifica los STRs por detección automática de fluorescencia, gracias al
programa de análisis de fragmentos (Fragment Manager).
El equipo está formado por dos placas de
vidrio (una de ellas es termoestática) que según su tamaño permiten un
recorrido electroforético de 8 a 20 cms. El extremo superior de ambos cristales
se trata con solución adherente, se colocan los separadores y el peine (de 0.3
ó 0.5 mm).
Solución fresca adherente:
-
1 ml de etanol
-
250 µl de ácido acético.
-
3.75
µl de Bind Silane
Solución de Electroforesis:
El
producto utilizado fue de Pharmacia®, ReproGel High Resolution. Corresponden a
dos soluciones que al exponer la mezcla a la luz ultravioleta se polimeriza en
diez minutos. Gel que puede ser utilizado si el valor del láser permanece
estable, por lo que se utilizaron placas de 8 cm con menor recorrido
electrofóretico.
Los
productos PCR fueron preparados previamente para posteriormente cargar cada
pocillo:
-
1,8 µl de producto amplificado (muestra o láder)
-
3 µl de tampón de carga, azul de dextrano 5 mg/ml en formamida desionizada
-
Marcadores internos de peso molecular (Sizer 100, 150, 250 de Pharmacia
Biotech®; 114 y 402 pb.)
En el gel se incluyeron dos
calles con un marcador externo de peso molecular (sizer 50-500, Pharmacia
Bioteche®). Los marcadores internos de peso molecular 114 y 402 son derivados
de una hebra de ADN del bacteriófago M13mp18 (Pharmacia Biotech®). Para
realizar estas amplificaciones se utilizaron 1 ng de M13, 10 pMoles de cada
cebador, en un volumen final de reacción de 50 µl.
Los fragmentos de ADN generados
son de distintos tamaños que van en función de los cebadores utilizados:
P1: *5´ CGA CGT TGT AAA ACG ACG
GCC AGT 3´
-
P2 (114pb): 5´CAG ACA GGA AAC AGC TAT GA 3´
-
P2 (402 pb): 5´TGG ACC GCT TGC TGC AA 3
El termociclador GeneAmp System
2400 desarrolló el siguiente programa:
-
Inicio: Desnaturalización 95 °C, 2 minutos
-
25 ciclos:
n Desnaturalización 95° C, 50
segundos.
n Acomplamiento 55° C, 40 segundos
n Extensión 72 °C, 50 segundos
-
Final: Conservación 4°C hasta su procesamiento.
Las muestras fueron
desnaturalizadas por calentamiento a 95°C durante 5 minutos, y se conservaron
en hielo hasta cargarlas, para que el ADN no se renaturalizara de nuevo. El
recorrido electroforético se llevó a cabo bajo las siguientes condiciones:
-
Voltaje: 1500 voltios (V/cm)
-
Potencia: 30 vatios (W)
-
Intensidad: 60 miliamperios (mA)
-
Temperatura: 55°C
-
Tiempo de recorrido: 90 minutos en placas pequeñas.
El tamaño de los microsatélites
se determinó automáticamente con el software ALFwin Fragment Manager (Pharmacia®, Suecia) que
cuantifica el tamaño de los fragmentos gracias a los marcadores de peso
molecular. El fenotipado de los alelos se realizó al comparar con el láder
alélico, incluido al menos una vez cada cinco calles.
El programa permite la
visualización de los resultados de tres formas diferentes: el modo de gel
ofrece una imagen del recorrido electroforético en la placa, el diseño de
curvas permite una sencilla comparación visual de la cantidad de producto
amplificado y de los alelos tipados, la presentación en tablas de los
resultados, ofrece una interpretación numérica de los alelos gracias a los marcadores
de peso molecular específicos para cada
uno de ellos, según se investigue.
METODO ESTADÍSTICO:
Su
interés antropológico y medico-legal en el estudio de las poblaciones y su
acervo génico radica en determinar el rango de variabilidad según la distribución
de frecuencias de los polimorfismos ADN, los que presentan características
específicas para cada grupo poblacional. Medico-legalmente es imprescindible
conocer esas diferencias ya que son las
frecuencias de perfiles genéticos los que sustentan los cálculos de
probabilidad en la resolución de las peritaciones.
PARÁMETROS
GENÉTICOS-POBLACIONALES:
1.- Genética de
Poblaciones: Es la descripción
algebraica de la constitución genética de una población y de la forma en que
las frecuencias alélicas cambian en las poblaciones a lo largo del tiempo. El
conocimiento de la distribución de los diferentes alelos de un sistema
polimórfico en la población de referencia, es el primer paso para la
elaboración de un informe pericial en Genética Forense.
Frecuencia Génica: Mide la
proporción relativa de alelos en una población. Se expresa en tanto por ciento
o en tanto por uno, y se calculan mediante el recuento de cada alelo dividido
entre el número total de alelos analizados (Cavalli-Sforza y Bodmer, 1981)
2.- Equilibrio de
Hardy – Weinberg: Es un principio básico en la genética de poblaciones. Según
esta ley, en una población de gran tamaño y en panmixia, las frecuencias
génicas, así como también las frecuencias genotípicas, permanecen constantes de
generación en generación. La estimación de frecuencias génicas en una población
de referencia, si es adecuada, debe reflejar que se cumple este equilibrio.
Su comprobación puede efectuarse
por numerosos métodos agrupados fundamentalmente en dos categorías (Carracedo y
Barros, 1996ª): Test de bondad de ajuste de grandes muestras (X² de Pearson) y
Test exactos. Este último su principal problema se da al aumentar el número de
alelos y de individuos de la muestra, los cálculos se hacen extremadamente
complejos por lo que se hace necesario recurrir al uso de sofisticados
programas informáticos como lo son el programa HWE- análisis versión 3.0
(Christoph Puers, Institute for Legal Medicine, University of Münster)
Un exceso de homocigotos en la población
objeto de estudio podría ser explicado por un proceso de aislamiento y
endogamia.
3.- PARÁMETROS
ESTADÍSTICOS DE INTERES MEDICO-LEGAL:
n Probabilidad de Exclusión a
priori (PE): Este parámetro se define como la probabilidad de que un sistema
genético específico dé evidencias que conduzcan a la exclusión de un sospechoso
(Boyd, 1954). Permite establecer la proporción de individuos falsamente
implicados en una peritación. Es un
valor estadístico porcentual en función directa del polimorfismo de un marcador
genético, de forma que cuanto más polimórfico es un sistema y más equilibrada
este la frecuencia de sus alelos, tanto mayor será su probabilidad de exclusión
a priori. Muy útil en la Investigación de Paternidad (Nievas, 2001).
n Probabilidad de Exclusión
acumulativa (Pecum): Es un valor que se utiliza
para determinar la eficacia que a priori posee un laboratorio. En algunos
sistemas como el español, se considera que un laboratorio está capacitado para
realizar pruebas de paternidad cuando alcanza al menos un 99 % de probabilidad
de exclusión a priori.
n Índice de Heterocigosidad o
Diversidad génica: Representa la probabilidad de que dos alelos del mismo locus
tomados al azar en una población sean distintos. Se define como el número de
individuos heterocigotos observados con respecto al total analizado guardando
relación con el grado de polimorfismo del sistema estudiado y su eficacia como
marcador genético. Es importante para conocer la estructura de la población y
en comparaciones interpoblacionales.
n Probabilidad de match o
coincidencia: Probabilidad de que dos individuos al azar tengan idénticos
genotipos en uno o varios sistemas genéticos dados.
n Poder de discriminación:
Probabilidad de que dos individuos no emparentados entre sí y tomados al azar
puedan ser diferenciados genéticamente mediante el análisis de un marcador o
conjunto de marcadores genéticos.
II. RESULTADOS
PARÁMETROS GENETICOS
POBLACIONALES:
Los resultados que se obtuvieron
al analizar los STRs de cromosoma Y, dentro de la población de Nicaragua, se
encuentran las frecuencias alélicas, las frecuencias genotípicas/haplotípicas y el número de alelos para cada uno de los
marcadores estructurados en tablas y gráficos, en donde se comentan los
aspectos más sobresalientes de los mismos.
STRs DEL CROMOSOMA Y:
Los loci analizados se
encuentran dentro del haplotipo mínimo recomendado para fines forenses: DYS19
(Sistema Uniplex); GEPY II (Sistema Multiplex) (GATA A7.1, DYS439, GATA H4 Y
GATA A10).
7.1 DYS19:
Se encontraron 5 alelos con
repeticiones entre 13 y 17 pb. Los alelos más frecuentes fueron el 13 y 14,
presentando frecuencias de 0.32 y 0.37 respectivamente.
Tabla No. 6. Frecuencia
alélica del locus STR DYS19 en población nicaragüense.
|
Alelos |
No. |
Frecuencia Alélica |
|
13 |
51 |
0.32 |
|
14 |
58 |
0.37 |
|
15 |
29 |
0.18 |
|
16 |
16 |
0.1 |
|
17 |
4 |
0.03 |
|
Total |
158 |
1,00 |
Frecuencias
Variantes Alélicas
Gráfico
No. 8. Frecuencia alélica del locus STR DYS19 en
población nicaragüense.
7.2 SISTEMA MULTIPLEX DE CROMOSOMA Y: En la tabla No.7, se resumen las frecuencias
alélicas que se encontraron en los cuatro loci del cromosoma Y, analizados
mediante el sistema multiplex (GEPY II):
Tabla No. 7. Frecuencias alélicas GEPY II
|
ALELOS |
A7.1 |
A10 |
DYS439 |
H4 |
||||
|
Nº
|
Frecuencia |
Nº
|
Frecuencia |
Nº
|
Frecuencia |
Nº
|
Frecuencia |
|
|
7 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
8 |
2 |
0.01 |
|
|
|
|
|
|
|
9 |
16 |
0.10 |
|
|
1 |
0.01 |
|
|
|
10 |
60 |
0.39 |
|
|
5 |
0.03 |
|
|
|
11 |
64 |
0.41 |
|
|
12 |
0.08 |
|
|
|
12 |
16 |
0.09 |
3 |
0.02 |
30 |
0.19 |
|
|
|
13 |
|
|
13 |
0.08 |
70 |
0.44 |
|
|
|
14 |
|
|
19 |
0.12 |
40 |
0.25 |
|
|
|
15 |
|
|
56 |
0.35 |
|
|
|
|
|
16 |
|
|
53 |
0.34 |
|
|
|
|
|
17 |
|
|
12 |
0.08 |
|
|
|
|
|
18 |
|
|
2 |
0.01 |
|
|
|
|
|
25 |
|
|
|
|
|
|
3 |
0.02 |
|
26 |
|
|
|
|
|
|
5 |
0.03 |
|
27 |
|
|
|
|
|
|
28 |
0.18 |
|
28 |
|
|
|
|
|
|
55 |
0.35 |
|
29 |
|
|
|
|
|
|
67 |
0.42 |
El primer locus, GATA A7.1,
mostró un total de 5 variantes alélicas de
Frecuencia
Alélica
Alelos
Gráfico No. 9.Distribución alélica del locus GATA A7.1
El marcador GATA A10, mostró una
más amplia distribución alélica con 7 variantes y repeticiones entre 12 y 18.
Los que más frecuencia se presentaron fueron los de 15 y 16 repeticiones con 56
y 53 casos, respectivamente (0.35 y 0.34%); siendo el menos frecuente las
repeticiones 12 y 18 (0.02 y 0.01%) (Gráfrico No.10)
Frecuencia Alélica
Alelos
Gráfico No.10.
Distribución alélica del locus GATA A10.
El DYS439, presentó 6 variantes
alélicas entre 9 y 14 repeticiones, siendo el más frecuente la variante 13 con
70 casos (0.44%) y los menos frecuentes las variantes 9 y 10 con 1 y 5 casos,
respectivamente (0.01 y 0.03%) (Gráfico
No.11)
Frecuencias Alélicas Alelos
Gráfico No.11.
Distribución alélica del locus GATA439.
El último locus del sistema
multiplex estudiado es el GATA H4. En él se detectaron 5 alelos, comprendidos
entre 25 y 29 repeticiones; siendo los de 28 y 29 repeticiones los de mayor
frecuencia con 55 y 67 casos respectivamente (0.33 y 0.44%) y las repeticiones
25 y 26 las de menor frecuencia con 3 y 5 casos (0.03 y 0.04%) (Gráfico No.12)
Alelos
Gráfico No.12. Distribución alélica del STR
GATA H4.
7.3 Distribución
Haplotípica de STRs DYS19 / GATA II
Sobre el total de 158 personas
del sexo masculino analizadas dentro de la población de Nicaragua mediante
cinco sistemas hipervariables de cromosoma Y, fueron detectados un total de 56
haplotipos diferentes (Tabla No.8) Siendo dos de ellos los de mayor frecuencias
haplotípicas con el 0,07%. Esto indica que siete de cada cien personas,
mediante esta cantidad de sistemas analizados, comparten la misma combinación
de marcadores de cromosoma Y.
En la tabla No. 9, se resume
como un todo, uno a uno, los 158 casos en estudio de estos cinco sistemas
hipervariables de cromosoma Y.
Tabla No. 8.
Distribución Haplotípica más frecuente de STRs DYS19 / GATA II, en 158 manchas
sanguíneas masculinas de la población de Nicaragua.
|
|
HAPLOTIPO |
No. de Casos |
PORCENTAJE |
|
1 |
13 - 8 - 12 - 9
- 25 |
1 |
0,006 |
|
2 |
13 - 9 - 13 - 10 - 25 |
1 |
0,006 |
|
3 |
13 - 9 - 13 - 11 - 26 |
1 |
0,006 |
|
4 |
13 - 9 - 13 - 11 - 27 |
1 |
0,006 |
|
5 |
13 - 9 - 14 - 11 - 27 |
1 |
0,006 |
|
6 |
13 - 9 - 14 - 12 - 27 |
1 |
0,006 |
|
7 |
13
- 10 - 14 - 12 - 27 |
6 |
0,038 |
|
8 |
13 - 10 - 15 - 12 - 28 |
5 |
0,032 |
|
9 |
13 - 10 - 15 - 13 - 28 |
9 |
0,057 |
|
10 |
13 - 10 - 16 - 13 - 28 |
4 |
0,025 |
|
11 |
13 - 11 - 16 - 13 - 28 |
2 |
0,013 |
|
12 |
13 - 11 - 16 - 13
- 29 |
8 |
0,051 |
|
13 |
13 - 11 - 16 - 14 - 29 |
4 |
0,025 |
|
14 |
13 - 11 - 17 - 14 - 29 |
6 |
0,038 |
|
15 |
13 - 12 - 18 - 14 - 29 |
1 |
0,006 |
|
16 |
14 - 8 - 12 - 10
- 26 |
1 |
0,006 |
|
17 |
14 - 9 - 13 - 10 -
26 |
1 |
0,006 |
|
18 |
14 - 9 - 13 - 11 - 26 |
1 |
0,006 |
|
19 |
14 - 9 - 13 - 11 - 27 |
1 |
0,006 |
|
20 |
14 - 9 - 14 - 11 - 27 |
2 |
0,013 |
|
21 |
14 - 9 - 14 - 12 - 27 |
2 |
0,013 |
|
22 |
14 - 10 - 14 - 12 - 27 |
2 |
0,013 |
|
23 |
14 - 10 - 15 - 12 - 27 |
3 |
0,019 |
|
24 |
14 - 10 - 15 - 12 - 28 |
5 |
0,032 |
|
25 |
14 - 10 - 15 - 13 - 28 |
6 |
0,038 |
|
26 |
14 - 10 - 15 - 13 - 29 |
4 |
0,025 |
|
27 |
14 - 11 - 15 - 13 - 29 |
3 |
0,019 |
|
28 |
14 - 11 - 16 - 13 - 29 |
11 |
0,070 |
|
29 |
14 - 11 - 16 - 14 - 29 |
11 |
0,070 |
|
30 |
14 - 11 - 17 - 14 - 29 |
1 |
0,006 |
|
31 |
14 - 12 - 17 - 14 - 29 |
3 |
0,019 |
|
32 |
14 -12 - 18 - 14 - 29 |
1 |
0,006 |
|
33 |
15 - 9 - 13 - 11
- 27 |
1 |
0,006 |
|
34 |
15 - 9 - 14 - 11 - 27 |
1 |
0,006 |
|
35 |
15 - 9 - 14 - 12 - 27 |
1 |
0,006 |
|
36 |
15 -
10 - 14 - 12 - 27 |
1 |
0,006 |
|
37 |
15 - 10 - 14 - 13 - 27 |
2 |
0,013 |
|
38 |
15 - 10 - 15 - 13 - 28 |
7 |
0,044 |
|
39 |
15 - 11 - 15 - 13 - 28 |
5 |
0,032 |
|
40 |
15 - 11 - 16 - 13 - 29 |
2 |
0,013 |
|
41 |
15 - 11 - 16 - 14 - 29 |
4 |
0,025 |
|
42 |
15 - 12 - 16 - 14 - 29 |
4 |
0,025 |
|
43 |
15 - 12 - 17 - 14 - 29 |
1 |
0,006 |
|
44 |
16 - 9 - 12 - 10
- 25 |
1 |
0,006 |
|
45 |
16 - 10 - 13 - 10 - 25 |
1 |
0,006 |
|
46 |
16 - 10 - 13 - 11 - 26 |
2 |
0,013 |
|
47 |
16 - 10 - 13 - 12 - 27 |
2 |
0,013 |
|
48 |
16 - 10 - 13 - 12 - 28 |
1 |
0,006 |
|
49 |
16 - 11 - 14 - 13 - 28 |
1 |
0,006 |
|
50 |
16 - 11 - 15 - 13 - 28 |
4 |
0,025 |
|
51 |
16 - 12 - 16 - 14 - 28 |
1 |
0,006 |
|
52 |
16 - 12 - 16 - 14 - 29 |
2 |
0,013 |
|
53 |
16 - 12 - 17 - 14 - 28 |
1 |
0,006 |
|
54 |
17 - 10 - 15 -
11 - 28 |
1 |
0,006 |
|
55 |
17- 10 - 15 - 12 - 28 |
1 |
0,006 |
|
56 |
17 - 11 - 15 - 13 - 29 |
2 |
0,013 |
Gráfico No.13.
Distribución Haplotípica más frecuente de STRs DYS19 y GATA II en 158 manchas
sanguíneas masculinas de la población de Nicaragua.
Haplotipo
Frecuencias
Haplotípicas
Tabla No.9.
Distribución haplotípica de cinco sistemas STRs. de Cromosoma Y estudiados en
158 muestras sanguíneas de población nicaragüense.
|
DYS19 |
A7.1 |
A10 |
DYS439 |
H4 |
|||||
|
Us. Alélica |
pb |
Us.
Alélica
|
pb. |
Us.
Alélica |
pb. |
Us.
Alélica |
pb. |
Us.
Alélica |
pb. |
|
13 |
186 |
10 |
122 |
14 |
163 |
11 |
247 |
27 |
283 |
|
15 |
196 |
11 |
128 |
15 |
169 |
13 |
254 |
28 |
287 |
|
13 |
189 |
11 |
128 |
16 |
170 |
13 |
252 |
29 |
288 |
|
14 |
192 |
11 |
128 |
15 |
166 |
13 |
252 |
29 |
288 |
|
14 |
191 |
11 |
128 |
15 |
167 |
12 |
248 |
29 |
289 |
|
15 |
196 |
10 |
123 |
15 |
169 |
11 |
247 |
28 |
284 |
|
14 |
192 |
9 |
118 |
15 |
169 |
11 |
247 |
27 |
283 |
|
14 |
192 |
11 |
127 |
15 |
169 |
11 |
247 |
29 |
288 |
|
17 |
202 |
10 |
124 |
15 |
167 |
13 |
253 |
28 |
286 |
|
14 |
193 |
10 |
124 |
16 |
170 |
13 |
253 |
28 |
286 |
|
15 |
197 |
10 |
124 |
16 |
171 |
13 |
254 |
28 |
287 |
|
14 |
195 |
12 |
129 |
16 |
172 |
14 |
257 |
29 |
291 |
|
15 |
194 |
11 |
126 |
15 |
169 |
13 |
253 |
29 |
291 |
|
17 |
202 |
10 |
123 |
15 |
167 |
12 |
250 |
29 |
288 |
|
15 |
196 |
11 |
128 |
17 |
175 |
13 |
255 |
29 |
201 |
|
14 |
190 |
11 |
128 |
16 |
170 |
12 |
250 |
29 |
291 |
|
14 |
193 |
11 |
128 |
16 |
171 |
12 |
249 |
29 |
291 |
|
16 |
198 |
10 |
123 |
13 |
158 |
10 |
243 |
25 |
275 |
|
16 |
198 |
11 |
125 |
13 |
161 |
11 |
246 |
26 |
278 |
|
16 |
200 |
10 |
124 |
13 |
160 |
11 |
245 |
26 |
277 |
|
14 |
190 |
11 |
125 |
13 |
161 |
11 |
246 |
26 |
278 |
|
13 |
186 |
11 |
126 |
14 |
162 |
12 |
248 |
27 |
280 |
|
15 |
194 |
12 |
130 |
15 |
166 |
13 |
253 |
27 |
281 |
|
15 |
198 |
12 |
129 |
15 |
166 |
13 |
253 |
27 |
281 |
|
14 |
190 |
12 |
131 |
15 |
168 |
13 |
255 |
27 |
283 |
|
16 |
199 |
12 |
132 |
15 |
169 |
14 |
256 |
28 |
284 |
|
14 |
194 |
12 |
131 |
15 |
169 |
13 |
255 |
28 |
284 |
|
15 |
198 |
12 |
132 |
16 |
170 |
13 |
253 |
28 |
285 |
|
14 |
190 |
12 |
132 |
16 |
170 |
13 |
254 |
28 |
286 |
|
15 |
197 |
12 |
130 |
16 |
172 |
13 |
255 |
28 |
287 |
|
16 |
198 |
11 |
127 |
17 |
174 |
14 |
258 |
29 |
289 |
|
15 |
194 |
11 |
126 |
16 |
171 |
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186 |
10 |
123 |
15 |
169 |
13 |
255 |
29 |
291 |
|
14 |
191 |
11 |
127 |
15 |
168 |
12 |
250 |
27 |
283 |
|
14 |
190 |
11 |
127 |
14 |
165 |
14 |
256 |
28 |
286 |
|
15 |
194 |
11 |
127 |
15 |
168 |
14 |
256 |
27 |
282 |
|
15 |
194 |
10 |
124 |
15 |
168 |
13 |
252 |
28 |
284 |
|
14 |
192 |
10 |
124 |
16 |
171 |
12 |
251 |
28 |
284 |
III. DISCUSIÓN
Y ANÁLISIS
La realización de este trabajo conllevó inherentemente, muchas condiciones adversas en el campo del tiempo al no poderse abarcar durante el estudio un número mayor de marcadores genéticos de cromosoma Y en conjunto con otros marcadores de tipo autosómicos.
Es importante mencionar que los resultados obtenidos durante este estudio se limitan al planteamiento porcentual de Frecuencias Alélicas, Genotípicas/Haplotípicas; sin lograr contemplar otros parámetros estadísticos de genética poblacional de importancia en criminalística forense. Sin embargo, se tiene que para poder admitir la realización de cálculos de Probabilidad de informes poblacionales, primero debe emplearse la distribución de frecuencias de la población en referencia para buscar como obtener valores de probabilidad más ajustadas a la realidad, requisito nulo en el inicio de nuestro trabajo, dado lo novedoso y desconocido en el quehacer cotidiano de nuestro sistema investigativo; además de las condiciones económicas por la falta de recursos técnicos en nuestro sistema de trabajo.
En criminalística forense la validez de un sistema genético depende de la Probabilidad de Exclusión a priori. Probabilidad que va a indicar la posibilidad de que una persona acusada sea descartada o no por uno o varios sistemas genéticos. Un valor que es específico para cada marcador en dependencia de su polimorfismo y su distribución poblacional; lo que quiere decir que, a mayor variación que presente un sistema polimorfico, mayor capacidad de diferenciar a unas personas de otras.
Durante el desarrollo de este trabajo siempre se cumplió con las recomendaciones de Gill (1997) en el manejo de las muestras para evitar los problemas de “contaminación” o mezclas; agregándole otras medidas básicas como lo fueron el uso de bata y guantes en todos los procedimientos. Hubo separación, implementado en la propia infraestructura del laboratorio, de las áreas de extracción y amplificación, en donde además de lo anterior se exigió el uso de mascarilla y descontaminación de las zonas de extracción / amplificación mediante irradiación con luz ultravioleta al finalizar diariamente cada proceso.
Para evitar este tipo de situaciones también nos vimos en la necesidad de:
- Tipar genéticamente a todo el personal del laboratorio.
- Repetir los análisis por lo menos en dos ocasiones.
- Uso de muestras de referencias.
- Realización de controles positivos y negativos.
- Uso de láderes alélicos secuenciados.
- Uso de marcadores de peso molecular externo e interno durante la secuenciación.
- Conocimiento indispensable y exhaustivo del comportamiento de los marcadores a analizar.
CONSIDERACIONES RETOMADAS DURANTE
Nos encontramos que al igual que la detección automatizada del patrón alélico de los loci STRs proporciona una información cualitativa acerca del perfil de ADN (los alelos presentes), también la experiencia del examinador es capaz de proporcionar datos aceptables en cuanto a la cantidad de ADN amplificada al tomar como referencia la intensidad de las bandas y el área del pico presentado por el alelo en el electroferograma.
Por otro lado el uso de marcadores de peso molecular, externo e interno, ayudan a acortar el rango en el que aparecen los picos correspondientes a los alelos para cada marcador. El marcador externo, generalmente se corrió en las calles 5 y 35, obteniendo una mejor visualización del gel de 40 muestras. (Gráfico No. 14)
Gráfico No. 14. Calle 5, de izquierda a derecha se
muestra el marcador externo de
3 2 1
Se tuvo mucho cuidado al observar que, en algunas ocasiones, la cantidad del marcador externo corrido en el gel, daba lugar a la aparición de efecto pull-up en las calles adyacentes cuando éste estaba presente en mucha cantidad.
El sistema monocromático ALF utilizado durante este trabajo, tiene muchas ventajas pero también muchos inconvenientes para la detección de los productos amplificados. Entre sus ventajas observadas se destacan la facilidad de ejecución, interpretación y almacenamiento de la información y la rápida obtención de los resultados. Sin embargo, es un sistema que ha quedado desfasado rápidamente debido al surgimiento de otros sistemas policromáticos y sistemas de electroforesis capilar (ABI Prism 373 y 377, ABI Prism 3100, ABI 310, MegaBACE 500) que ofrecen mayores ventajas y comodidades a la hora de trabajar en la rutina forense. Sistemas con programas informáticos de gran utilidad al trabajar con sistemas multiplex con un número elevado de loci (hasta ese momento de 20 a 23 loci en un mismo procedimiento).
El secuenciador utilizado en esta ocasión, nos planteó una gran desventaja por el hecho de ser incompatible con los kits comerciales, lo que obligó a una mayor inversión de tiempo y dinero, a pesar de que sus resultados fueron nítidos, fiables y de fácil lectura. Este tipo de secuenciador obliga a un gasto mayor de muestra de ADN amplificado, ya que el número de loci que amplifican en cada PCR es menor.
Otro detalle importante durante el estudio fue la detección electroforética de bandas “stutter” o bandas tartamudas, las que en presencia de un examinador inexperto pueden desorientar una investigación criminal y recurrir a un error en la interpretación de los perfiles ADN; sobretodo, cuando el tamaño del producto stutter es cercano al límite del 15% del tamaño de la banda principal, tamaño establecido para su consideración como tal (Walsh y cols, 1996; Butler, 2001) (Gráfico No. 15)
Gráfico No. 15. Retomando el gráfico anterior, se observa
sobre la calle 21, una banda “stutter”, señalado con una flecha y encerrado en
un círculo.
IV. CONCLUSIONES
PRIMERA
El análisis de los cinco marcadores polimórficos de cromosoma Y estudiados (DYS19, GATA A7.1, GATA A10, DYS439 y GATA
H4) da lugar al inicio de la creación de una
Base de Datos de marcadores genéticos cuyo uso venga a facilitar, en el ramo de
la criminalística biológica de Nicaragua, la identificación genética en las
investigaciones de identidades vinculadas a los casos de filiación parental e
identificación de los responsables en casos de delitos sexuales por violación,
homo y heterosexual. Sin embargo, esto exige incrementar en cantidad el número
de marcadores genéticos que conlleven a obtener un valor discriminativo más
aceptable para un mayor potencial informativo dentro de los informes
periciales.
SEGUNDA
El estudio en su conjunto refleja una
herencia haplotípica, hasta el avance actual, de 56 haplotipos diferentes como
resultados de las combinaciones alélicas de los cinco marcadores analizados;
advirtiéndose de la existencia, aun mayor, de combinaciones alélicas sin
estudiar hasta tanto no darle continuidad a este trabajo, lo que llevaría al
conocimiento de su frecuencia real.
TERCERA
Las frecuencias haplotípicas obtenidas con el
presente estudio vienen a reconfirmar la gran limitante que presenta el
análisis de forma única de los marcadores polimórficos de cromosoma Y para la
identificación genética poblacional, al demostrar que todos aquellos individuos de una misma línea paterna comparten
igual información genética de sus haplotipos; razón que hace pensar
erróneamente en que la población estudiada es meramente endogámica por su alta
incidencia homocigótica.
CUARTA
La aplicabilidad de los marcadores genéticos
estudiados se ve muy limitada por no disponer con un estudio mayor o
representativo de la cantidad de marcadores genéticos.
V. RECOMENDACIONES
PRIMERA
Dado este primer paso, sugiero y recomiendo dar
continuidad y ampliar el presente estudio con el análisis de nuevos sistemas de
marcadores genéticos, a fin de establecer comparaciones con otras poblaciones
centroamericanas para un aporte mayor a la implementación de este sistema
investigativo en Nicaragua.
SEGUNDA
Para evitar criterios como lo descrito en la
parte tercera de las conclusiones se hace necesario que estos estudios tengan
que acompañarse conjuntamente con análisis de marcadores autosómicos para
descartar cualquier nexo o vínculo parental que pudiera existir entre cada
individuo estudiado.
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